硫酸鹽還原菌的分離純化及脫硫性能研究

孔赟，葉建龍,2, 杜昊臻，李哲天，魯浩，賀武明，廉晶晶，陳奇

1.長江大學資源與環境學院，湖北 武漢 430100 2.貴州大學資源與環境工程學院，貴州 貴陽 550025

硫酸鹽還原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)是一類能通過異化作用將硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等含硫氧化物作為有機物的電子受體還原成硫化氫的厭氧微生物[1-3]，其在石化含硫廢水、礦山含硫廢水及高濃度有機含硫廢水中應用極為廣泛[4-7]；同時，該類微生物還原產生的硫化氫可對金屬產生腐蝕作用[8,9]。目前在廢水處理領域報道的已有9個屬，其中弧菌屬(Desulfovibrio)和脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)最為常見[1,10-13]。

針對石化含硫廢水污染日益嚴重、污染組分繁多、可生化性能差等問題，從提高石化含硫廢水處理效果和安全高效微生物脫硫技術角度出發，通過分離培養出純度高的SRB菌種，考察不同環境因素對其脫硫性能的影響，以期為石化含硫廢水的零排放治理技術和資源化利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

含油污泥及石化廢水于2018年7月取自江漢油田采油廠潭34站、廣9站和花園站油井三相分離器，共采集油泥和廢水樣品6個，采集后于—20℃低溫冰箱保存待用。

SRB菌種富集培養基(液體培養基)：蛋白胨 10g、牛肉膏 5g、NaCl 5g、FeSO4·7H2O 0.5g和蒸餾水1L。

篩選培養基(固體培養基)：K2HPO4·3H2O 0.5g、NH4Cl 1g、MgSO4·7H2O 0.06g、Na2SO42.5g、CaCl2·2H2O 0.06g、檸檬酸三鈉0.3g、乳酸鈉4g、酵母膏1g、瓊脂20g和蒸餾水1L。培養基用0.1mol/L或1mol/L的HCl將pH調節為6.3后，分裝至三角瓶中，放入高壓滅菌鍋于121℃滅菌20min，冷卻后取出待用。

硫酸鹽溶液配制：準確稱量1.4479g的FeSO4·7H2O置于燒杯中，蒸餾水溶解，倒入500mL容量瓶中定容，獲得硫酸鹽質量濃度為1000mg/L(以硫酸根質量濃度計)的母液備用；硫酸鹽去除效果實驗中硫酸鹽溶液質量濃度采用該母液進行稀釋。

1.2 試驗方法

1.2.1 SRB分離純化

在超凈工作臺分別取5g含油污泥或5mL石化廢水接種至盛有100mL富集培養基的三角瓶中，于恒溫生化培養箱中28℃條件下富集培養4～6d，當觀察到液體培養基大部分變黑且略微有臭雞蛋氣味產生時，表明SRB已大量繁殖；隨后采用稀釋涂布-疊皿夾層法和劃線法于篩選培養基上進行分離純化[2]，并獲得單一菌落。

1.2.2 SRB生理生化實驗

革蘭氏染色實驗參考文獻[18]，碳源和氮源利用實驗參考文獻[19]。

1.2.3 SRB脫硫實驗

1)不同菌株對硫酸鹽去除效果的影響。將不同SRB分別接種1～2環至盛有100mL富集培養基的三角瓶中，于28℃、100r/min轉速條件下恒溫培養48h得到發酵液；各取不同SRB菌株發酵液5mL分別加入100mL硫酸鹽質量濃度為200mg/L的三角瓶中，置于30℃恒溫培養箱中靜置培養，48h后測定硫酸鹽質量濃度。

2)菌株SRB-X2體積分數對硫酸鹽去除效果的影響。按體積比取適量SRB-X2發酵液(0.5%、1%、3%、5%和10%)分別加入100mL質量濃度為200mg/L的硫酸鹽溶液于三角瓶中，置于30℃恒溫培養箱中靜置培養，定期測定硫酸鹽質量濃度。

3)溫度對菌株SRB-X2脫硫效果的影響。取5mL菌株SRB-X2發酵液加入100mL質量濃度為200mg/L硫酸鹽溶液于三角瓶中，分別置于15、25、30、35、45和55℃的恒溫培養箱中靜置培養，定期測定硫酸鹽質量濃度。

4)pH對菌株SRB-X2脫硫效果的影響。用0.1mol/L的HCl(或NaOH)將100mL硫酸鹽溶液(初始質量濃度為200mg/L)的初始pH分別調節至3、5、6、7、8、9、11，隨后取5mL菌株SRB-X2發酵液分別加入上述三角瓶中，置于30℃恒溫培養箱中靜置培養，48h后測定硫酸鹽濃度。

5)硫酸鹽質量濃度對菌株SRB-X2脫硫效果的影響。各取5mL菌株SRB-X2發酵液分別加入100mL質量濃度為50、100、200、500、1000mg/L硫酸鹽溶液于三角瓶中，置于30℃恒溫培養箱中靜置培養，定期測定硫酸鹽質量濃度。

1.3 分析方法

硫酸鹽質量濃度采用離子色譜法測定[4]。硫酸鹽去除率計算式如下：

(1)

式中：R為硫酸鹽去除率，%；C0和C1分別為初始硫酸鹽質量濃度和處理后硫酸鹽質量濃度，mg/L。

2 結果與討論

2.1 SRB菌株分離純化及生理生化特性

從油泥和廢水樣品中共分離獲得16株純菌，菌株命名見表1，其中SRB-M8、SRB-D5、SRB-D6、SRB-D7和SRB-D8不能產生硫化氫，其余11株均具有產硫化氫活性，即為硫酸鹽還原菌。進一步考察了各菌株碳源利用、氮源利用及革蘭氏染色情況，結果表明，除SRB-M8不能利用葡萄糖和碳酸氫鈉外，15株SRB菌均能夠有效利用甲醇、乙醇、葡萄糖和檸檬酸三鈉等有機碳源及碳酸鈉、碳酸氫鈉等無機碳源；同時可以利用氨氮作為氮源，但不能以硝酸鹽或亞硝酸鹽為唯一電子受體進行生長代謝；革蘭氏染色結果顯示，產硫化氫菌株中SRB-M2、SRB-M3、SRB-M7、SRB-X1、SRB-X2和SRB-X3為革蘭氏陽性菌，其余為革蘭氏陰性菌。

表1 SRB菌株生理生化特性

不同硫酸鹽還原菌能夠利用的碳源種類有所差異。萬海清等[20]研究表明，脫硫弧菌屬能以甲醇、乙醇、乳酸、葡萄糖等有機物作為良好碳源，且消耗速率大小為乳酸>乙醇>甲醇>葡萄糖；SRB菌株BQ1可利用甲酸鈉、乳酸鈉、乙酸鹽等多種碳源[4]，SRB菌株WJ1則可利用丙酸鈉、乳酸鈉、乙酸鹽等多種碳源[14]。部分學者依據SRB碳源利用特征將其分為2大類[1,2,6]：第1類是可以利用乳酸、丙酮酸、乙醇或脂肪酸將硫酸鹽還原為硫化氫且不產生二氧化碳的微生物，包括脫硫弧菌屬、脫硫腸狀菌屬、脫硫葉菌屬及脫硫單胞菌屬等；第2類是將硫酸鹽還原為硫化氫的同時可以徹底將乙酸、草酰乙酸、乳酸或富馬酸等有機物氧化為二氧化碳和水的微生物，包括脫硫線菌屬和脫硫球菌屬等。鑒于分離的11株SRB均能利用甲醇、乙醇、檸檬酸等有機碳，推測分離獲得的SRB屬于第一類微生物。

2.2 不同菌株對硫酸鹽去除效果的影響

SRB對硫酸鹽的還原能力一定程度反應了菌株脫硫能力，研究考察了11株SRB的脫硫能力，結果見圖1，11株SRB對硫酸鹽均有去除效果，但在48h內對硫酸鹽的還原能力差異較大，去除率為(45.7±2.8)%～(92.1±5.2)%，其中菌株SRB-X2對硫酸鹽的還原能力最強，平均去除率高達92.1%。杜剛等[2]從環境樣品中分離純化得到9株SRB菌株，其中菌株SRB-12(Desulfovibriooxamicus)還原能力最強，對初始質量濃度為1700mg/L的硫酸鹽處理60h后去除率高達88.8%，其去除率略低于菌株SRB-X2。

圖1 不同菌株對硫酸鹽去除效果的影響

2.3 菌株SRB-X2體積分數對硫酸鹽去除效果的影響

菌株SRB-X2體積分數對硫酸鹽去除效果的影響見圖2，當SRB-X2體積分數為10%時，對硫酸鹽的去除效果最佳，去除率高達98%且不隨反應時間的延長而變化。當SRB-X2體積分數為0.5%～5%時，硫酸鹽去除率隨著菌液體積分數的增加及處理時間的延長而增加，且不同菌液接體積分數(0.5%、1%、3%、5%)對硫酸鹽的去除率在72h時最高，分別為(42.5±3.7)%、(57.5±4.2)%、(83.2±4.5)%和(97.3±3.2)%。鑒于當菌液體積分數為5%和10%時，在72h對硫酸鹽的去除效果相當，后續試驗采用SRB-X2的體積分數為5%進行。

圖2 菌株SRB-X2體積分數對硫酸鹽去除效果的影響 圖3 溫度對菌株SRB-X2脫硫效果的影響

2.4 溫度對菌株SRB-X2脫硫效果的影響

SRB通常分為中溫SRB和嗜熱SRB，其最適宜生長溫度分別為28～38℃和54～70℃[20]。為考察菌株SRB-X2最佳脫硫溫度，比較分析了不同溫度條件下其對硫酸鹽的去除效果(見圖3)，結果顯示，菌株SRB-X2在15～55℃范圍內均可生長且對硫酸鹽的去除率為67%以上，其中30℃去除率最佳，反應48h時去除率高達(99.3±0.6%)，表明菌株SRB-X2屬中溫菌，其生長溫度為25～35℃，最佳溫度為30℃。楊春璐等[4]從渤海灣某高溫油田采出水中分離獲得1株耐高溫、耐鹽SRB菌株BQ1，其可在14～70℃條件下生長代謝，且在30℃培養時產生的硫化氫濃度最大，表明菌株BQ1在30℃時脫硫效果最佳，該菌株脫硫的最佳溫度與SRB-X2一致。

2.5 pH對菌株SRB-X2脫硫效果的影響

酸堿性直接影響硫酸鹽還原酶系統的構象、性質及生物學活性，其對SRB脫硫性能影響較大[20]。pH對菌株SRB-X2脫硫效果的影響見圖4，pH由3增加至11時硫酸鹽的去除率呈現先增后減的變化趨勢，脫硫效果最佳pH為6～7，去除率高達98.5%。楊春璐等[14]研究發現，菌株WJ1在pH為5～10時可生長且能產硫化氫，其最適pH約為8；當pH小于3或高于11時幾乎不能產生硫化氫；而菌株BQ1僅在pH為6～9時可產生硫化氫，最適pH為7[4]。綜合比較發現，菌株SRB-X2對環境pH適應能力較強。

圖4 pH對菌株SRB-X2脫硫效果的影響

2.6 硫酸鹽質量濃度對菌株SRB-X2脫硫效果的影響

考察了硫酸鹽質量濃度范圍為50～1000mg/L時菌株SRB-X2的脫硫能力，結果見圖5。分析可得，株菌SRB-X2能夠有效去除硫酸鹽且去除率高于65%，在相同處理時間的條件下硫酸鹽的去除率隨著起始濃度的增加而逐漸降低。當起始質量濃度為1000mg/L時，SRB-X2在24、48、72h對硫酸鹽的去除率分別為(68.1±3.6)%、(68.3±3.2)%和(67.5±2.1)%，反應時間對硫酸鹽的去除效果無明顯影響；當起始質量濃度低于200mg/L時，硫酸鹽的去除率隨著反應時間的增加顯著增加，其中當硫酸鹽起始質量濃度為200mg/L時菌株SRB-X2在24、48、72h對硫酸鹽的去除率分別為(85.7±3.9)%、(91.8±3.6)%和(95.6±3.2)%，表明脫硫效果較好。

圖5 硫酸鹽質量濃度對菌株SRB-X2脫硫效果的影響

3 結論

采用稀釋涂布-疊皿夾層法和劃線分離法從江漢油田含油污泥和石化廢水中篩選獲得多株硫酸鹽還原菌，并重點考察了不同影響因素對菌株SRB-X2脫硫性能的影響，得到主要結論如下:

1)分離所獲得的11株SRB菌株均能夠有效利用甲醇、乙醇、葡萄糖和檸檬酸三鈉等有機碳源及碳酸鈉、碳酸氫鈉等無機碳源；同時可以利用氨氮作為氮源，但不能以硝酸鹽或亞硝酸鹽為唯一電子受體進行生長代謝；菌株SRB-M2、SRB-M3、SRB-M7、SRB-X1、SRB-X2和SRB-X3為革蘭氏陽性菌，其余為革蘭氏陰性菌。

2)菌株SRB-X2對硫酸鹽的還原能力最強。當SRB-X2菌液體積分數為0.5%～5%時，硫酸鹽去除率隨著菌液體積分數的增加及處理時間的延長而增加，且菌液體積分數為5%的處理組對硫酸鹽的去除效果最佳，在72h的去除率為(97.3±3.2)%。

3)溫度、pH和硫酸鹽初始質量濃度對菌株SRB-X2脫硫性能具有顯著影響。株菌SRB-X2最佳脫硫溫度為30℃，pH為6～7；該菌株能夠有效去除初始質量濃度為1000mg/L的硫酸鹽且去除率高于65%，在相同處理時間情況下硫酸鹽的去除率隨著初始質量濃度的增加而逐漸降低，其中硫酸鹽初始質量濃度為200mg/L時，24、48、72h的去除率分別為(85.7±3.9)%、(91.8±3.6)%和(95.6±3.2)%，脫硫效果較好。