蛋白質磷酸酶2A激活劑對星形膠質細胞遷移能力的影響及作用機制研究

張黎軍 趙盼盼 徐志秀 王凡 王朔 任靜 袁彬 吉四輩

星形膠質細胞是膠質細胞中體積最大的一種，在哺乳動物腦內分布最為廣泛，在血腦屏障形成、神經系統調節中起到重要作用[1]。有研究顯示，星形膠質細胞在細胞遷移中參與了神經退行過程[2]，在中樞神經系統中發揮了傳遞神經遞質等多種生物學作用。星形膠質細胞可以在帕金森病患者及帕金森病動物模型中呈現出活化狀態，在病理狀態下其線粒體功能受損[3]。膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達上調是活化狀態的主要表現，若抑制GFAP的表達，神經損傷后軸突再生功能會大幅度降低。李燕華等[4]研究結果表明，慢病毒轉染基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9會下調水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）的表達，這可為利用星形膠質細胞進行缺血性腦水腫實驗提供參考。MMP-2、MMP-9均屬于基質金屬蛋白酶家族[5]，兩者在細胞中發揮著重要作用[6]。蛋白質磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是一種異源三聚體蛋白，能夠參與多種生物學功能的調節。有研究表明，PP2A升高對轉基因損傷小鼠神經功能有一定的改善作用[7]，p38是絲裂原活化蛋白激酶中重要成員，參與細胞信號轉導過程[8-9]。本研究探討PP2A激活劑對星形膠質細胞遷移能力的影響及相關作用機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗動物：選取出生48 h內健康、清潔級SD雄性大鼠，均由華北理工大學科學院提供[許可證號：SYXK（冀）2020-007]。飼養溫度 20～25 ℃，濕度為50%，人工飼養3 d。（2）主要試劑：大鼠抗小鼠磷酸化 p38（phosphorylation of p38，p-p38）抗體由武漢益普生物科技有限公司提供，PP2A活性試劑盒由上海瓦蘭生物科技有限公司提供；人抗大鼠MMP-2抗體、MMP-9抗體由上海恒斐生物科技有限公司提供。本研究經醫院醫學倫理委員會批準（批準文號：21000092017072）。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質細胞培養 參照張黎軍等[10]星形膠質細胞的培養方法：采用75%乙醇對大鼠消毒，以斷頸法處死，快速將大鼠大腦組織取出并放置在平皿中，連續洗滌3次，提取大鼠大腦皮層組織，剝除血管膜并剪碎，加入0.125%胰蛋白酶2 ml消化15 min，每3 min進行1次搖晃，待其完全消化后，將其置于含有10%FBS的杜爾貝科伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）中，加入適量細胞培養液使細胞懸浮，隨后在細胞培養瓶中培養，培養環境為5%CO2、37℃。每3 d更換1次培養液，9 d后密封培養瓶，置于37℃搖床中，待細胞分離后檢測膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GEAP）表達，若檢測陽性，即提示星形膠質細胞培養完成。更換培養液，重復以上步驟，選取第2代星形膠質細胞備用。

1.2.2 細胞分組 將培養后的第2代星形膠質細胞分為抑制組、激活組、對照組3組。抑制組加入15 nmol/L PP2A抑制劑岡田酸；激活組加入15 nmol/L PP2A激活劑鞘胺醇（d-erythro-sphingosine，DES）；對照組加入等體積二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），每組細胞在用乙二胺四乙酸胰酶消化后，以5×104/ml的密度接種在鋪有蓋玻片（預先采用多聚賴氨酸包被）的6孔板內，在5%CO2、37℃下恒溫培養箱內培養48 h后，備用。

1.2.3 PP2A活性檢測 采用放射免疫沉淀法，3組細胞均加入細胞裂解液，在冰上裂解20 min后轉移至微型離心管（micro centrifuge tube，EP）中，在 4 ℃下離心處理10 min，分離蛋白上清液后在EP內保存，采用二喹啉甲酸蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，滴加50 μg蛋白樣品后，采用PP2A活性檢測試劑盒完成PP2A活性檢測。

1.2.4 星形膠質細胞遷移率的觀測 采用細胞染色觀察法。采用胰蛋白酶將3組細胞完全消化，分別滴加含有1%FBS培養懸液細胞，細胞濃度為1×105個/ml，在 Transwell小室上室中加入 500 μl細胞懸液，在Transwell小室下室中加700 μl 10%的FBS細胞液，將Transwell小室放置在12孔板上，培養8 h后，使用棉簽將上層多余細胞擦掉，固定5 min。采用日本奧林巴斯BX43光學顯微鏡觀察細胞遷移數目，在25℃下使用Giemsa染料染色15 min后統計遷移總細胞數目，并計算細胞遷移率，細胞遷移率=遷移總細胞數目/膜下層細胞×100%，重復上述步驟3次，取平均值。

1.2.5 p-p38、MMP-2、MMP-9的檢測 采用電泳洗滌法。提取3組細胞中總蛋白，加入5×十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate crystals，SDS）上樣緩沖液，每孔劑量20 μg。于120 V電壓下，電泳1.5 h至形成聚偏二氟乙烯膜后，采用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS with tween-20，TBST），p-p38、MMP-2、MMP-9按照1:2 000稀釋或在溫室下孵育12 h后在4℃條件下進行震蕩過夜，再次洗滌，加入二抗溶液 TBST，p-p38、MMP-2、MMP-9 按照 1∶5 000 稀釋，震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH作為內參蛋白。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組細胞PP2A活性比較 3組細胞PP2A活性比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。抑制組PP2A活性51.22±8.98，低于激活組的135.89±11.25及對照組的102.15±10.15，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；激活組PP2A活性高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 3組細胞遷移率的比較 3組細胞遷移率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。抑制組細胞遷移率0.15±0.02，低于激活組的0.42±0.03及對照組的 0.23±0.01，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；激活組細胞遷移率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。光學顯微鏡下3組細胞遷移情況見圖1。

圖1 光鏡下3組細胞遷移情況（×100）

抑制組細胞外基質內的細胞遷移數目低于激活組、對照組；激活組細胞外基質內的細胞遷移數目高于對照組。

2.3 3組細胞中 p-p38、MMP-2、MMP-9 表達水平比較 3組細胞中p-p38、MMP-2、MMP-9表達水平比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。抑制組pp38表達水平高于對照組、激活組，激活組p-p38表達水平低于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。抑制組MMP-2、MMP-9表達水平均低于對照組、激活組，差異均有統計學意義（t=22.360、12.280、17.000、12.330，均 P＜0.05）；激活組 MMP-2、MMP-9 表達水平高于對照組，差異均有統計學意義（t=7.000、3.796，均P＜0.05），見表 1。3 組 p-p38、MMP-2、MMP-9 表達水平比較見圖2、圖3。

表1 3組細胞中p-p38、MMP-2、MMP-9表達水平比較

圖2 3組p-p38蛋白表達的電泳圖

圖3 3組MMP-2、MMP-9表達的電泳圖

3 討論

星形膠質細胞與神經系統關系密切，對神經細胞的生長具有一定的營養作用，在神經系統中具有廣泛的生物學功能[11]。李昕華等[12]研究結果表明，處理后的星形膠質細胞分泌膠質細胞源性神經營養因子能起到抑制p38MAPK信號通路的作用，并且抑制神經元細胞的減少，發揮保護腦神經的作用。

PP2A含有較大數量的三聚體，對細胞中多種蛋白能起到直接作用，在多種生物學功能中發揮關鍵作用[13]。有研究表明，其活性的降低能夠破壞神經元軸突功能的發揮[14]。本研究結果顯示，激活組PP2A活性明顯高于抑制組、對照組，此結果說明，PP2A激活劑能提高機體中PP2A活性。細胞遷移屬于一種細胞運動，在多種過程中均發揮著重要作用，如傷口愈合、癌癥進展、免疫反應等[15]。本研究結果顯示，激活組細胞遷移率明顯高于抑制組、對照組，此結果說明，PP2A激活劑能夠顯著促進星形膠質細胞遷移，從而提高星形膠質細胞遷移的能力。李夏春等[16]研究結果表明，上調PP2A能夠改善淀粉樣前體蛋白/早老蛋白-1雙轉基因小鼠病理改變，具有改善學習記憶能力的作用，與本文研究結果一致。趙鑫等[17]研究中，采用Transwell小室細胞遷移實驗和細胞劃痕實驗檢測小干擾RNA調節ski基因（ski gene-small interfering RNA，ski-siRNA）轉染后星形膠質細胞遷移能力的變化發現，ski-siRNA轉染組每孔遷移細胞數少于空白對照組和陰性對照組。細胞劃痕實驗顯示,轉染組細胞1～5 d的劃痕愈合率均明顯低于對照組，證實沉默ski基因能顯著抑制星形膠質細胞的遷移能力。

MMP-2、MMP-9兩者在細胞中發揮著重要作用。盧文玉等[18]研究結果表明，ApoE能夠調節膠質細胞分泌的MMP-9表達，影響血腦屏障完整性。本研究結果顯示，激活組中MMP-2、MMP-9表達水平明顯高于抑制組、對照組，說明PP2A激活劑通過上調MMP-2、MMP-9表達，可促進星形膠質細胞的遷移。

p38參與細胞信號轉導過程。本研究中，激活組p-p38表達量較抑制組、對照組較低，說明PP2A激活劑通過降低p-p38磷酸化水平，從而降低了p38水平。雷雨廣等[19]研究結果表明，PDIA3過表達能夠改善H2O2誘導的星形膠質細胞氧化應激損傷及炎性反應，其能夠通過抑制p38MAPK通路的激活發揮其作用。邵廣田等[20]研究結果顯示，缺氧組p-p38表達顯著高于正常組,而缺氧+SB203580組p-p38表達顯著低于缺氧組，說明p38信號通路的激活降低了缺氧下星形膠質細胞增殖并促進細胞的凋亡，而抑制p38信號通路可提高細胞的增殖及抑制細胞的凋亡。本文研究尚未證實這一觀點，因此仍需要做后續實驗加以證實。

綜上所述，PP2A激活劑通過調控p38MAPK信號通路，能提高星形膠質細胞中PP2A活性及星形膠質細胞遷移能力，為臨床研究神經系統損傷提供理論依據。