阿托伐他汀通過Nrf2/HO-1改善慢性心力衰竭大鼠心功能的作用及機制研究

任慧敏 韓樹池 苑 萌 馬力豐 李文卉

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心臟疾病的終末階段，對患者的日常生活及遠期預后均產生不利影響[1-2]。近年關于CHF發病機制的研究認為，氧化應激反應的過度激活與心肌損傷及重構、心臟結構和功能改變有關。核因子 E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)通路是體內重要的抗氧化通路，腹主動脈縮窄法建立的CHF大鼠模型中及異丙腎上腺素誘導心肌細胞肥大模型中均檢測到Nrf2及HO-1表達降低，激活Nrf2顯著改善CHF大鼠的心功能，提示激活Nrf2是防治CHF的重要靶點[3-5]。阿托伐他汀是臨床上廣泛使用的調脂藥物，王志利等[6]的動物實驗證實阿托伐他汀對急性心肌梗死大鼠的心功能具有改善作用，對缺血心肌組織中Nrf2/HO-1通路具有激活作用，基于此提出假說：阿托伐他汀可能在心臟中參與Nrf2/HO-1通路的調控，進而可作為防治CHF的藥物。為了驗證這一假說，本研究通過腹主動脈縮窄法建立CHF大鼠模型，分析阿托伐他汀通過激活Nrf2/HO-1通路改善CHF大鼠心功能的效果及機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF級雄性SD大鼠，體質量180～200 g，8～10周齡[購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司，生產許可SCXK(滬)2017-0012]。

1.2 藥品與試劑 阿托伐他汀鈣(輝瑞制藥公司，美國)，Nrf2抑制劑ML385(MCE公司，美國)、用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配置儲存液(濃度為25 mg/mL)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-hydroxy deoxyguanine，8-OHdG)、總抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測試劑盒(南京建成研究所，中國江蘇)，組織裂解液(碧云天公司，中國上海)，Nrf2、HO-1、β-actin單克隆一抗(Abcam公司，美國)。

1.3 儀器 小動物超聲儀(S-Sharp公司，美國)，凝膠電泳儀(Bio-rad公司，美國)，凝膠成像儀(天能公司，中國上海)。

1.4 方法

1.4.1 分組、造模及給藥 實驗動物隨機分為假手術(SHAM)組、CHF組、阿托伐他汀組、DMSO+SHAM組、DMSO+CHF組、DMSO+阿托伐他汀組、ML385+阿托伐他汀組，每組各8只。采用腹主動脈縮窄法建立CHF模型：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后打開腹腔、暴露腹主動脈，用5.5號注射器針頭緊貼腹主動脈并結扎，而后抽出針頭、完成手術；SHAM組進行腹腔麻醉、暴露腹主動脈的假手術操作，但不結扎。術后第2天對相應實驗組開始進行干預，阿托伐他汀的劑量為10 mg/kg、ML385的劑量為30 mg/kg，阿托伐他汀用生理鹽水配置，ML385用含有10% DMSO的生理鹽水配置，給藥方式均為灌胃，灌胃體積10 mL/kg，每天1次，連續8周。

1.4.2 心功能的超聲檢測 給藥8周后，采用小動物超聲儀進行檢測，放置探頭、取乳頭肌切面、獲得超聲圖像，測量左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular shortening fraction，LVFS)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)，左心室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)。

1.4.3 心臟大體形態的觀察 完成心功能超聲檢測后，稱體質量，處死大鼠并解剖得到心臟，觀察心臟的大體形態并稱心臟質量，計算心臟體質量比。

1.4.4 心肌中氧化應激指標的檢測 計算心臟體質量比后，取左心室的心肌組織適量，加入組織裂解液進行勻漿，勻漿液在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心10 min，分離上清液，采用試劑盒檢測蛋白濃度及MDA、8-OHdG、T-AOC濃度，計算每毫克蛋白中MDA、8-OHdG、T-AOC的水平。

1.4.5 心肌中Nrf2、HO-1表達水平的檢測 另取左心室心肌組織勻漿后的離心上清液，與上樣緩沖液混合后煮沸變性，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳以分離不同分子量的蛋白，而后電轉膜至硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜放入5% 脫脂牛奶中室溫孵育1 h，洗膜3次后放入1∶1 000稀釋的Nrf2、HO-1一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗中4 ℃孵育過夜。次日洗膜3次后放入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶二抗中孵育1 h，最后在凝膠成像儀中用ECL法顯影得到Nrf2、HO-1、β-actin的蛋白條帶，根據條帶灰度值、以β-actin為內參，計算Nrf2、HO-1的表達水平。

2 結果

2.1 阿托伐他汀對CHF大鼠心功能的調節作用 CHF組的LVEDD、LVESD均高于SHAM組，LVEF、LVFS均低于SHAM組(P<0.05)；阿托伐他汀組的LVEDD、LVESD均低于CHF組，LVEF、LVFS均高于CHF組(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS的比較

2.2 阿托伐他汀對CHF大鼠心臟大體形態的調節作用 CHF組的心臟體質量比、心臟股骨頸比均高于SHAM組(P<0.05)；阿托伐他汀組的心臟質量、心臟體質量比均低于CHF組(P<0.05)。見表2。

2.3 阿托伐他汀對CHF大鼠心肌中氧化應激指標的調節作用 CHF組心肌中MDA、8-OHdG的水平均高于SHAM組，T-AOC的水平低于SHAM組(P<0.05)；阿托伐他汀組心肌中MDA、8-OHdG的水平均低于CHF組，T-AOC的水平高于CHF組(P<0.05)。見表3。

表2 3組大鼠心臟質量、心臟體質量比的比較

表3 3組大鼠心肌中MDA、8-OHdG、T-AOC的比較

2.4 阿托伐他汀對CHF大鼠心肌中Nrf/HO-1通路的調節作用 CHF組心肌中Nrf2、HO-1的表達水平低于SHAM組(P<0.05)；阿托伐他汀組心肌中Nrf2、HO-1的表達水平高于CHF組(P<0.05)。見圖1。

注：A，3組間Nrf2表達的比較；B，3組間HO-1表達的比較。

表4 3組大鼠心肌中Nrf2、HO-1表達水平的比較

2.5 ML385對阿托伐他汀激活CHF大鼠心肌中Nrf/HO-1通路的影響 DMSO+CHF組心肌中Nrf2、HO-1的表達水平低于DMSO+SHAM組(P<0.05)；DMSO+阿托伐他汀組心肌中Nrf2、HO-1的表達水平高于DMSO+CHF組(P<0.05)；ML385+阿托伐他汀組心肌中Nrf2、HO-1的表達水平低于DMSO+阿托伐他汀組(P<0.05)。見圖2。

注：A，4組間Nrf2表達水平的比較；B，4組間HO-1表達水平的比較。

表5 4組大鼠心肌中Nrf2、HO-1表達水平的比較

2.6 ML385對阿托伐他汀改善CHF大鼠心功能的影響 DMSO+CHF組的LVEDD、LVESD均高于DMSO+SHAM組，LVEF、LVFS均低于DMSO+SHAM組(P<0.05)；DMSO+阿托伐他汀組的LVEDD、LVESD均低于DMSO+CHF組，LVEF、LVFS均高于DMSO+CHF組(P<0.05)；ML385+阿托伐他汀組的LVEDD、LVESD均高于DMSO+阿托伐他汀組，LVEF、LVFS均低于DMSO+阿托伐他汀組(P<0.05)。見表6。

表6 4組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS的比較

2.7 ML385對阿托伐他汀改善CHF大鼠心臟大體形態的影響 DMSO+CHF組的心臟質量、心臟體質量比均高于DMSO+SHAM組(P<0.05)；DMSO+阿托伐他汀組的心臟質量、心臟體質量比均低于DMSO+CHF組(P<0.05)；ML385+阿托伐他汀組的心臟質量、心臟體質量比均高于DMSO+阿托伐他汀組(P<0.05)。見表7。

表7 4組大鼠心臟質量、心臟體質量比的比較

2.8 ML385對阿托伐他汀改善CHF大鼠心肌氧化應激的影響 DMSO+CHF組心肌中MDA、8-OHdG的水平均高于DMSO+SHAM組，T-AOC的水平低于DMSO+SHAM組(P<0.05)；DMSO+阿托伐他汀組心肌中MDA、8-OHdG的水平均低于DMSO+CHF組，T-AOC的水平高于DMSO+CHF組(P<0.05)；ML385+阿托伐他汀組心肌中MDA、8-OHdG的水平均高于DMSO+阿托伐他汀組，T-AOC的水平低于DMSO+阿托伐他汀組(P<0.05)。見表8。

表8 4組大鼠心肌中MDA、8-OHdG、T-AOC的比較

3 討論

冠脈粥樣硬化造成的心肌缺血，高血壓造成的心臟后負荷增加，擴張型心肌病造成心臟前負荷增加等是引起CHF的常見病因。心肌細胞損害、心臟舒縮功能減退、體循環灌注不足、肺循環淤血是CHF主要的病理生理特征，可引起臟器功能損害、心血管事件發生風險增加，臨床危害大、需要進行積極防治。阿托伐他汀是心血管領域常用的藥物，具有調脂、穩定斑塊、降低心腦血管疾病發生風險的作用。近些年，有臨床研究發現，阿托伐他汀用于CHF的治療對患者心功能具有改善作用[7-8]，相應的基礎研究也在心肌梗死模型[6]、糖尿病心肌病模型[9]中發現阿托伐他汀對心功能的改善作用。本研究將CHF大鼠為對象，旨在探究阿托伐他汀治療CHF的作用及機制。

腹主動脈縮窄術是通過增加心臟收縮后負荷建立CHF模型的常用方法[10-11]，本研究通過心超檢查觀察到LVEDD、LVESD增加的心腔擴大表現及LVEF、LVFS降低的心臟舒縮功能減退表現，同時通過心臟大體形態的觀察發現心臟質量及心臟體質量比均增加，符合CHF發病的病理生理特征，也與既往研究[10-11]中腹主動脈縮窄術建立CHF動物模型的特征一致。在進行腹主動脈縮窄術后給予阿托伐他汀灌胃8周，結果發現阿托伐他汀干預使CHF大鼠心腔擴大及心臟舒縮功能減退的表現得到改善，并且心臟質量及心臟體質量比降低，表明阿托伐他汀對CHF大鼠的心功能具有改善作用。

本研究將對相關的分子機制進行探索，旨在更加深入認識阿托伐他汀治療CHF的價值及CHF發病相關的病理生理機制。目前認為，炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等均與CHF發病過程中心肌細胞損害、心室重構等均密切相關，其中氧化應激不僅直接損害心肌細胞，還對炎癥反應、細胞凋亡均具有刺激作用[12-14]。多項研究[15-16]將氧化應激作為研究CHF發病機制及治療手段的關鍵靶點。本研究在CHF大鼠的心肌中檢測到氧化應激產物MDA、8-OHdG水平增加，反映抗氧化的T-AOC水平降低，符合CHF發病過程中氧化應激激活的特征。阿托伐他汀在心血管系統中不僅發揮調脂的藥理作用，多項研究也證實阿托伐他汀對心肌細胞、內皮細胞的氧化應激反應具有抑制作用[17-19]。本研究使用阿托伐他汀灌胃對CHF大鼠進行干預后，心肌中MDA、8-OHdG水平降低，T-AOC水平增加，表明阿托伐他汀在CHF的治療中起到抗氧化作用，這可能是阿托伐他汀改善CHF大鼠心功能的相關機制。

Nrf2/HO-1是在氧化應激中起抗氧化作用的重要通路，Nrf2是一種轉錄因子，表達增加并向細胞核轉移后能夠啟動HO-1的表達，進而發揮清除自由基、減輕細胞損傷的抗氧化作用。在CHF、心肌梗死、心肌缺血再灌注等病理生理過程中，心肌中Nrf2/HO-1通路均受到抑制，由該通路介導的抗氧化作用減弱[3-5, 20]。本研究也證實CHF大鼠心肌中Nrf2、HO-1的表達降低，經阿托伐他汀灌胃干預后心肌中Nrf2、HO-1的表達增加，這一結果與CHF大鼠心肌中氧化應激激活、阿托伐他汀減輕氧化應激的作用吻合。為了進一步明確阿托伐他汀對CHF大鼠心功能的改善作用及氧化應激的抑制作用與Nrf2/HO-1通路的關系，本研究在阿托伐他汀灌胃的同時加入Nrf2抑制劑ML385，通過使用ML385抑制Nrf2/HO-1通路、降低Nrf2及HO-1表達水平，阿托伐他汀改善CHF大鼠心功能及氧化應激的作用均削弱，表明阿托伐他汀所發揮的生物學作用部分與激活Nrf2/HO-1通路有關。

綜上所述，阿托伐他汀對CHF大鼠的心功能具有改善作用，這一作用與激活Nrf2/HO-1通路、減輕氧化應激反應有關。