頭孢氨芐聚合物分析方法優化

王新輝

（華北制藥股份有限公司 倍達分廠，河北 石家莊 052165）

0 引言

頭孢氨芐為第一代半合成頭孢菌素，該藥為口服制劑，是一種早期常見的抗生素，能抑制細胞壁的合成，主要用于敏感菌所致的呼吸道感染、尿路感染、皮膚軟組織感染等的治療。

研究證明，高分子雜質是β-內酰胺類抗生素的過敏源之一，β-內酰胺類抗生素單體分子在特定條件下能聚合形成高分子聚合物，而這些藥物的過敏反應發生率與高分子聚合物的含量成正相關系，而非β-內酰胺類抗生素本身。因此對高分子聚合物的分析是質量控制的關鍵。

針對目前華北制藥股份有限公司頭孢氨芐聚合物原檢測方法中主峰與其前相鄰雜質峰不能做到基線分離，影響檢驗結果準確性的情況，對其檢驗方法中的條件進行優化并驗證，通過方法的優化，為檢測頭孢氨芐聚合物的準確性提供可靠的依據。

1 檢測方法

色譜條件：用TSK-GELG2000SWXL色譜柱，以[0.005 mol/LNaH2PO4溶 液-0.005 mol/LNa2HPO4溶液（39∶61） ]-乙腈（95∶5） 為流動相；流速為0.6 mL/min；檢測波長為220 nm。

系統適用性要求供試品溶液色譜圖中，頭孢氨芐峰與相鄰雜質峰間的分離度應＞1.5。

2 檢測方法優化

2.1 流動相中有機相的比例優化實驗

系統適用性溶液：取供試品溶液適量70 ℃水浴加熱30 min。

2.1.1 流動相配制

分別選用磷酸鹽緩沖液｛0.005 mol/L 磷酸氫二鈉溶液-0.005 mol/L 磷酸二氫鈉（61∶39）｝，與乙腈按不同比例（100∶0、95∶5、90∶10、85∶15）混合。

2.1.2 試驗過程

取系統適用性溶液進樣。

2.1.3 圖譜

不同強溶劑比例條件下的系統適用性色譜圖如圖1 所示。

圖1 不同強溶劑比例條件下的系統適用性色譜Fig.1 Chrogram of system opplicability under different strong solvent ratio

2.1.4 試驗結果

隨著有機相濃度的提高，主峰與前相鄰峰的分離效果變差并且沒有達到基線分離，100%濃度緩沖鹽中主峰與前相鄰峰之間疑似還有未完全分離的峰，而磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5 的比例中主峰與前相鄰峰分離較好，因此選擇磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5 作為流動相。

2.2 流動相pH 值的優化試驗

2.2.1 流動相配制

磷酸鹽緩沖液｛0.005 mol/L 磷酸氫二鈉溶液-0.005 mol/L 磷酸二氫鈉（61∶39）｝，磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5，用磷酸和氫氧化鈉調磷酸鹽緩沖鹽的pH 值為5.0、6.0、7.2、8.0。

2.2.2 試驗過程

取系統適用性溶液進樣。

2.2.3 圖譜

不同緩沖液pH 值條件下的系統適用性色譜如圖2 所示。

圖2 不同緩沖液pH 值條件下的系統適用性色譜Fig.2 Chromatography of system applicability under different buffer pH value conditions

2.2.4 試驗結果

頭孢氨芐主峰前雜質峰與主峰的分離度隨著磷酸鹽緩沖鹽的pH 值的增大而逐漸變差，其中pH=6.0 的分離較好，因此選擇pH=6.0 的緩沖鹽作為流動相A。

2.3 流速的優化

2.3.1 流動相配制

磷酸鹽緩沖液｛0.005 mol/L 磷酸氫二鈉溶液-0.005 mol/L 磷酸二氫鈉（61∶39）｝，磷酸鹽緩沖液∶乙腈=95∶5，pH=6.0，分別采用不同的流速為0.5、0.6、0.7 mL/min。

2.3.2 試驗過程

取系統適用性溶液進樣。

2.3.3 圖譜

試驗中不同流速條件下的系統適用性色譜如圖3 所示。

圖3 不同流速條件下的系統適用性色譜Fig.3 Chrogram of system applicability at different flow rates

2.3.4 試驗結果

流速為0.5 mL/min 條件下的圖譜主峰與前雜質峰的分離效果最佳。

2.4 不同濃度的磷酸鹽緩沖鹽優化

2.4.1 流動相配制

試驗分別選用濃度為0.0025、0.005、0.01、0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖液｛磷酸氫二鈉溶液-磷酸二氫鈉（61∶39）｝，磷酸鹽緩沖液與乙腈混合（95∶5）。

2.4.2 試驗過程

取系統適用性溶液進樣。

2.4.3 圖譜

不同緩沖鹽濃度條件下的系統適用性色譜如圖4 所示。

圖4 不同緩沖鹽濃度條件下的系統適用性色譜Fig.4 Chrogram of systematic applicability under different buffer salt concentrations

2.4.4 試驗結果

分別對不同濃度的磷酸鹽緩沖液進行了考察，結果顯示，0.0025 與0.005 mol/L 緩沖鹽濃度均可實現基線分離。因此，進一步對0.0025 和0.005 mol/L 的緩沖鹽離子濃度進行試驗選擇。

2.5 篩 選

2.5.1 流動相配制

{磷酸氫二鈉溶液-磷酸二氫鈉（61∶39） 用磷酸調節pH=6.0｝：乙腈=95∶5,使用的磷酸鹽緩沖液濃度為0.0025、0.005 mol/L。

2.5.2 試驗過程

取系統適用性溶液、對照品溶液進樣。

2.5.3 圖譜

試驗中不同濃度緩沖鹽的系統適用性色譜如圖5 所示。

圖5 不同濃度緩沖鹽的系統適用性色譜Fig.5 Chrogram of the systematic applicability of different concentrations of buffered salts

0.0025 mol/L 緩沖鹽∶乙腈=95∶5 對照品溶 液色譜如圖6 所示。

圖6 0.0025 mol/L 緩沖鹽∶乙腈=95∶5 對照品溶液色譜Fig.6 Chrogram of control solution of 0.0025 mol/L buffer salt∶acetonitrile=95∶5

0.005 mol/L 緩沖鹽∶乙腈=95∶5 對照品溶液 色譜如圖7 所示。

圖7 0.005 mol/L 緩沖鹽∶乙腈=95∶5 對照品溶液色譜Fig.7 Chrogram of control solution of 0.005 mol/L buffer salt∶acetonitrile=95∶5

2.5.4 試驗結果

使用2 種不同緩沖鹽濃度（0.0025 和0.005 mol/L） 配制的流動相得到的系統適用性溶液圖譜的分離度均較好，主峰和主峰前雜質峰均能實現基線分離，但在緩沖鹽濃度為0.0025 mol/L 的流動相系統下得到的對照品溶液圖譜中頭孢氨芐峰分叉，峰形異常。因此采用0.005 mol/L 的緩沖鹽濃度為最終使用的緩沖液。

3 方法確定與方法驗證

3.1 方法確定

色譜條件：色譜柱：TSK-GELG2000SWXL；流動相的配置：以[0.005 mol/LNaH2PO4溶液-0.005 mol/LNa2HPO4溶液（39∶61） 用磷酸調節pH 值至6.0]-乙腈（95∶5）。

流速：0.5 mL；

檢測波長：220 nm。

系統適用性要求系統適用性溶液色譜圖中，頭孢氨芐峰與前相鄰雜質峰間的分離度應＞1.5。

3.2 分析方法驗證

3.2.1 檢測限

配制低濃度的頭孢氨芐標準溶液，調整此對照品溶液的濃度，以信噪比約3∶1 時的相應濃度作為檢測限。

經測試，溶液濃度為0.0514 μg/mL 時，信噪比為3.1∶1，此相應濃度作為檢測限。

3.2.2 定量限

配制低濃度的頭孢氨芐標準溶液，以信噪比約為10∶1 時的相應濃度作為定量限。

經測試，溶液濃度為0.182 μg/mL 時，信噪比為10.3∶1，此相應濃度作為定量限。

3.2.3 線性范圍

配置不同濃度的頭孢氨芐溶液，在定量限濃度-200%濃度范圍內配制6 個濃度的溶液，在測定條件下分別進樣，根據測得的峰面積對應的濃度進行線性回歸，頭孢氨芐線性方程：Y=52287138.9749x+302.2792；相關系數R 值為1.0000；在定量限濃度-200%濃度范圍內頭孢氨芐濃度與峰面積呈良好的線性關系。

3.2.4 精密度

3.2.4.1 重復性

分別制備供試品溶液6 份注入液相色譜儀，記錄色譜圖；結果表明：6 份供試品溶液測得的各聚合物含量的RSD 值為5.12%，＜限度20%，說明方法精密度良好。

3.2.4.2 中間精密度

由不同分析人員，在不同儀器條件下進行濃度測定，匯總2 組數據進行分析，計算結果的相對標準偏差，并對測定結果進行評價。結果表明：聚合物含量12 個數據的RSD 為6.79%，均＜20%，說明該方法中間精密度良好。

3.2.5 耐用性

通過改變流速、柱溫、檢測波長、色譜柱來考察分析方法的耐用性。

供試品溶液在4 ℃條件下分別于0、4、8、12、16、20、24 h 按聚合物方法進行檢測，考察溶液的穩定性。結果表明：供試品溶液在4 ℃條件放置24 h，各時間點與0 h 聚合物含量的RD 最大為4.77%，＜10.0%，說明4 ℃條件下供試品溶液可放置24 h。

通過改變流速（0.6±0.1 mL/min）、柱溫（25±5 ℃）、波長（220 nm±5 nm）、調整流動相比例及更換不同的色譜柱來考察分析方法的耐用性，每個條件均制備2 份供試品溶液進樣測定，同一變化條件下的6 個數據的RSD 值均＜20%，含量變化的絕對值在±0.1%，說明本方法測定頭孢氨芐聚合物耐用性良好。

4 結語

本實驗是在原檢測方法上對流動相中有機相的比例、流動相的pH 值、流速及不同濃度的緩沖鹽進行了優化實驗，優化后的檢測方法能夠做到基線分離，能較好地分離頭孢氨芐與其聚合物，并對確定好的優化方法進行了檢測限、定量限、線性范圍、精密度、耐用性的驗證，方法重現好，且精密度、準確度均能滿足質量控制的要求，對頭孢氨芐中聚合物的測定不會產生結果偏差，為檢測頭孢氨芐聚合物的準確性提供了可靠的依據。