宣肺止咳合劑對LPS 誘導的急性肺損傷模型大鼠AQP1 蛋白表達及炎癥反應的調節作用

何 瀠 王 瑩 計仁華 汪翼凡

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）引起急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是機體經受嚴重的感染、創傷、休克后引起的以肺部通透性增加、呼吸窘迫為主要表現的臨床危重癥，致死率高達30%[1]。當前肆虐全球的新型冠狀病毒肺炎，其重癥患者也常發展為ARDS[2]。尋找新的藥物和治療靶點，對早期預防和治療ALI 顯得極為迫切。浙江大學醫學院附屬杭州市胸科醫院自主研制的宣肺止咳合劑是治療上呼吸道感染、急性肺炎等的臨床常用方。課題組前期藥理實驗研究發現，宣肺止咳合劑能抑制內毒素（LPS）導致的急性肺損傷小鼠的肺組織水腫，降低血清中一氧化氮（NO）水平以及減輕肺泡間質炎性細胞浸潤，但作用機制尚不明確[3]。

LPS 是ALI 首要的致病因子，炎癥反應的失衡是其主要的發病機制，肺水腫是內毒素性ALI 并發急性呼吸功能衰竭的主要病理基礎[4-5]。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一組與水通透性有關的細胞膜轉運蛋白，在維持肺臟水液代謝平衡和肺泡水腫液的清除中發揮著重要的作用[6]。其中，AQP1 與肺損傷關系最為密切，可能是防治ALI 的重要靶點[7]。本實驗探討宣肺止咳合劑是否通過調控AQP1 蛋白表達及炎癥反應的平衡，從而對LPS 誘導的大鼠ALI 起治療作用，為宣肺止咳合劑的藥理機制提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SPF 級雄性Wistar 大鼠60只，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2013-0016。飼養條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，14h 光照和10h黑暗的環境明暗交替，換風次數15～20 次/h。由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心飼養。實驗飼養室許可證號SYXK（浙）2013-0184。

1.2 試劑 宣肺止咳合劑（院內制劑，批號180102）；LPS（Sigma 公司，批號039M4004V）；蘇木素染液（servicebio，批號G1004）；伊紅染液（珠海貝索生物技術有限公司，批號613101）；地塞米松（DEX）（源葉生物，批號H07N9Z74419）；AQP1（affinity 公司，批號AF5231）；β-actin（華安生物，批號EM21002）；BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio，批號pc0020）；化學發光檢測試劑（Solarbio，批號PE0010）；Trizol（生工，批號B511311）；SYBR Green qPCR 試劑盒（康為世紀，批號CW2601）；逆轉錄試劑盒（康為世紀，批號CW2569）；RIPA 裂解液（碧云天；批號P0013D）；白介素-1（IL-1）酶聯免疫試劑盒（批號March-2019）；IL-4 酶聯免疫試劑盒（批號March-2019）；IL-6 酶聯免疫試劑盒（批號March-2019）；IL-10 酶聯免疫試劑盒（批號March-2019）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫試劑盒（批號March-2019）。

1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡（日本尼康，型號Nikon Eclipse）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號RM2016）；酶標儀（MD，型號CMaxPius）；電泳儀（天能，型號EPS300）；化學發光儀（勤翔，型號610020-9Q）；實時熒光定量PCR 儀（羅氏，型號LightCycler 96）；核酸定量儀（Thermo Scientific，型號Nanodrop one）；生化培養箱（上海齊欣科學儀器有限公司，型號LRH-150）。

1.4 動物分組及處理 取健康SPF 級雄性Wistar大鼠60 只，隨機數字表法分為六組：正常對照組（灌胃生理鹽水，尾靜脈注射生理鹽水）；LPS 模型組（灌胃生理鹽水，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）；宣肺止咳合劑低劑量組（灌胃7.5mg/kg 宣肺止咳合劑，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）；宣肺止咳合劑中劑量組（灌胃15mg/kg 宣肺止咳合劑，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）；宣肺止咳合劑高劑量組（灌胃30mg/kg 宣肺止咳合劑，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）；陽性對照組（灌胃DEX 0.135mg/kg，尾靜脈注射LPS 5mg/kg）。其中生理鹽水劑量與給藥劑量一致。每天灌胃2 次，連續灌胃14d。末次給藥0.5h，除正常對照組外，其余各組尾靜脈注射LPS 5mg/kg，注射12h 后處死大鼠。

1.5 HE 染色觀察肺組織切片炎癥細胞浸潤和組織損傷情況 末次給藥后，取血后處死大鼠，取大鼠一葉左肺放于4%多聚甲醛中固定，取材包埋切片染色。圖像采集和分析：通過顯微鏡拍照（200 倍鏡下觀察），采集分析樣本相關部位。

1.6 免疫組化觀察LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 表達 組織切片常規脫蠟、水化、枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復，3% H2O2孵育10min 以消除內源性過氧化物酶活性，PBS 沖洗3 次。滴加封閉液（5%BSA），在濕盒中室溫30min。用濾紙擦去封閉液，滴加適宜濃度的一抗（均1∶50）置濕盒中4℃孵育過夜，用PBS 洗去一抗。滴加生物素化二抗工作液，室溫置濕盒中孵育20min，用PBS 洗去二抗。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫置濕盒中孵育20min，用PBS 洗去。DAB 顯色劑顯色，自來水充分沖洗。再進行蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。切片在10×20 倍顯微鏡下隨機選取組織不重復6個視野。

1.7 Western blot 檢測AQP1 蛋白表達 取100mg肝臟組織樣品，剪碎，加入1mL 冷Lysis Buffer，組織勻漿機中進行勻漿，離心取上清，用BCA 試劑盒測濃度后，進行蛋白變性，加入Loading buffer 保存待用；吸取適量樣品上清加入樣品孔中，經SDS-PAGE凝膠電泳80V 分離2h，350mA、90min 濕轉至PVDF膜。用5%脫脂奶粉的BSA 封閉2h，剪膜后分別加入一抗，4℃孵育過夜。TBST 洗膜后，分別加入相應的二抗，室溫下避光孵育1h，TBST 洗膜后ECL 化學發光儀顯影。用Image Studio Ver 2.0 軟件對蛋白灰度進行半定量分析。

1.8 qPCR 檢測AQP1 mRNA 表達 提取肺組織總RNA，按照康為世紀逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，反應條件：42℃，15min；85℃，5min；按照康為世紀SYBR Green qPCR 試劑盒進行實時熒光定量PCR 反應。反應條件：95℃，10min 變性；95℃，15s；60℃，60s；40 次循環。PCR 反應：Real time PCR 儀使用ABI7500 實時熒光定量PCR 儀，PCR 程序已優化。將已點好樣的8 連管板置于Realtime PCR 儀上進行PCR 反應。引物序列分別為：AQP1 上游引物：5′-ACCTGCTGGCCATTGACTAC3′-；AQP1 下游引物5′-CCAGGGCACTCCCAATGAAT3′-；GAPDH 上游引物：5′-AGGAGCGAGACCCCACTAACA3′-；GAPDH下游引物：5′-AGGGGGGCTAAGCAGTTGGT3′-。

1.9 ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 水平 大鼠心臟取血后，3500r/min 離心15min，分離血清，酶聯免疫吸附法檢測血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 的含量。操作步驟按試劑盒說明，反應終止后15min 內，用450nm 波長測量各孔的吸光值（OD 值）。

1.10 統計學方法 應用SPSS 16.0 統計軟件進行數據分析，所有符合正態分布數據以均數±標準差（）表示。組間比較，方差齊性者采用兩獨立樣本t檢驗，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE 染色觀察宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織病理學改變的影響 正常對照組肺泡結構完整，肺泡間質無明顯滲出。LPS 模型組肺泡間質滲出明顯，肺泡正常結構幾乎消失，可見大量炎性細胞浸潤。在給予宣肺止咳合劑或DEX 治療后，可見低劑量組大鼠肺組織無明顯改變，說明低劑量宣肺止咳合劑治療效果不明顯。中、高劑量組及陽性對照組大鼠肺組織肺泡簡直可見炎性細胞滲出，肺泡結構可見，損傷較模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織病理學改變的影響（HE 染色，200 倍）

2.2 免疫組化觀察宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 表達的影響 與正常對照組相比，LPS 模型組中AQP1 陽性表達明顯降低（P＜0.01）。給予宣肺止咳合劑或DEX 治療后，與LPS 模型組相比，宣肺止咳合劑低劑量組AQP1 陽性表達無明顯改變（P＞0.05）。宣肺止咳合劑中、高劑量組及陽性對照組AQP1 陽性表達明顯升高，且具有顯著性（P＜0.01）。見表1。

表1 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 表達的影響（）

表1 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 表達的影響（）

注：正常對照組予生理鹽水；LPS 模型組予生理鹽水；宣肺止咳合劑低劑量組予7.5mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑中劑量組予15mg/kg宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑高劑量組予30mg/kg 宣肺止咳合劑；陽性對照組予地塞米松0.135mg/kg；除正常對照組外，其余各組給藥14d 后給予LPS 5mg/kg 尾靜脈注射；Area 為面積參數值；LPS 為內毒素；IOD 為累積光密度參數值；與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

2.3 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 蛋白表達的影響 與正常對照組比較，LPS 模型組大鼠肺組織AQP1 蛋白表達水平顯著下調（P＜0.01）。與LPS 模型組比較，給藥組大鼠肺臟組織AQP1 蛋白表達水平呈現上調趨勢，宣肺止咳合劑不同給藥劑量呈現濃度依賴性，其中宣肺止咳合劑中劑量組和宣肺止咳合劑高劑量組有顯著性差異（P＜0.05 或P＜0.01），陽性對照組顯著上升趨勢（P＜0.01）。見表2 和圖3。

圖3 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織中AQP1 蛋白表達的影響

表2 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 蛋白表達的影響（）

表2 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 蛋白表達的影響（）

注：正常對照組予生理鹽水；LPS 模型組予生理鹽水；宣肺止咳合劑低劑量組予7.5mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑中劑量組予15mg/kg宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑高劑量組予30mg/kg 宣肺止咳合劑；陽性對照組予地塞米松0.135mg/kg；除正常對照組外，其余各組給藥14d 后給予LPS 5mg/kg 尾靜脈注射；LPS 為內毒素；與正常對照組比較，aP<0.01；與LPS 模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

圖2 免疫組化觀察宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織中AQP1 表達的影響（200 倍）

2.4 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 mRNA 水平的影響 與正常對照組相比，LPS 模型組大鼠肺組織中AQP1 mRNA 水平顯著降低（P<0.01）。與LPS 模型組相比，給藥組大鼠肺組織中AQP1mRNA 水平有升高趨勢，其中僅有宣肺止咳合劑低劑量組無顯著性變化（P＞0.05），其余各組顯著升高（P<0.01 或P<0.05）。見表3。

表3 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠肺組織AQP1 mRNA 水平的影響（）

注：正常對照組予生理鹽水；LPS 模型組予生理鹽水；宣肺止咳合劑低劑量組予7.5mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑中劑量組予15mg/kg宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑高劑量組予30mg/kg 宣肺止咳合劑；陽性對照組予地塞米松0.135mg/kg；除正常對照組外，其余各組給藥14d 后給予LPS 5mg/kg 尾靜脈注射；LPS 為內毒素；與正常對照組比較，aP<0.01；與LPS 模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

2.5 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 的影響 與正常對照組比較，LPS 模型組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 水平顯著升高（P＜0.01）。與LPS 模型組相比，給藥組中TNF-α、IL-1、IL-6 水平有降低趨勢，IL-10、IL-4 有升高趨勢，其中宣肺止咳合劑低劑量組大鼠血清僅有趨勢而無顯著性（P＞0.05）；宣肺止咳合劑中、高劑量組與LPS+陽性對照組大鼠血清呈顯著性趨勢（P＜0.05 或P＜0.01）。見表4。

表4 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 水平的影響（pg/mL，）

表4 宣肺止咳合劑對LPS 誘導急性肺損傷大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-4 水平的影響（pg/mL，）

注：正常對照組予生理鹽水；LPS 模型組予生理鹽水；宣肺止咳合劑低劑量組予7.5mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑中劑量組予15mg/kg 宣肺止咳合劑；宣肺止咳合劑高劑量組予30mg/kg 宣肺止咳合劑；陽性對照組予地塞米松0.135mg/kg；除正常對照組外，其余各組給藥14d 后給予LPS 5mg/kg 尾靜脈注射；LPS 為內毒素；與正常對照組比較，aP<0.01；與LPS 模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

3 討論

ALI 是ARDS 的早期階段，如果沒有得到有效的治療會進展成為ARDS，嚴重威脅患者的生命[8]。傳統中醫藥對ALI 的早期防治有著廣闊的應用前景。本院自主研制的宣肺止咳合劑（原名清肺飲，由麻黃、杏仁、生石膏、葛根、僵蠶、知母、甘草七味藥組成），具有清熱宣肺，止咳平喘之功，是用于治療上呼吸道感染、急慢性支氣管炎、小兒毛細支氣管炎、急性肺炎等病癥的臨床常用方[9-12]。本研究結果發現，給予宣肺止咳合劑或DEX 治療后，能明顯改善LPS 模型組肺泡間質滲出，減少炎性細胞浸潤，且中、高劑量組及陽性藥物組較低劑量組損傷明顯減輕。

ALI 發病機制錯綜復雜，主要涉及炎癥反應失控、氧化還原失衡、肺水代謝紊亂等許多層面?，F代醫學研究表明，LPS 是ALI 首要的致病因子[13]。肺水腫是內毒素性ALI 并發急性呼吸功能衰竭的主要病理基礎，主要表現為血管通透性增加、肺組織腫脹，組織間隙內大量液體集聚，以及炎性細胞浸潤等[14-15]。肺泡水腫液的清除可能是治療內毒素性肺損傷的關鍵措施。AQPs 是一組與水通透性有關的細胞膜轉運蛋白，大量研究證實AQPs 在肺水腫的形成和消除過程中起非常重要的作用，可能是防治ALI 的重要靶點[16]。其中AQP1 作為最早發現的水通道蛋白亞型，與肺損傷關系最為密切，研究表明，AQP1 敲除鼠，氣腔-毛細血管屏障水通透性下降約10 倍[7]。李波等[17]實驗研究發現，在LPS 誘導的ALI 模型中，表達于氣道和肺泡周圍毛細血管內皮細胞內的AQP1 明顯減少。鐘佰強[18]研究發現，LPS 性肺損傷后AQP1 的表達水平下降，DEX 干預后，AQP1 的表達明顯提高?？梢?，AQP1 在LPS 性ALI 中扮演著重要的角色。本研究結果發現，宣肺止咳合劑給藥組大鼠肺臟組織AQP1 蛋白表達、AQP1mRNA 水平較LPS 模型組呈現上調趨勢，宣肺止咳合劑不同給藥劑量呈現濃度依賴性，其中宣肺止咳合劑中、高劑量組和陽性藥對照組有顯著性差異（P<0.05 或P<0.01）。

ALI 的另一重要發病機制主要為促/抗炎反應失衡。LPS 誘導后可刺激細胞或組織釋放大量炎癥介質，包括促炎介質（TNF-α、IL-1、IL-6 等）和抗炎介質（IL-10、IL-4 等），兩者之間的平衡失調是ALI 發生發展的關鍵環節[17-18]。研究表明，TNF-α、IL-1、IL-6 等促炎因子可抑制肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞上AQPs 的表達，從而減少鈉離子的轉運及肺泡內液體清除，提示抑制促炎細胞因子的釋放及炎性反應能夠增加AQPs 的表達，進而促進肺泡內液體清除。本研究采用宣肺止咳合劑干預LPS 誘導的ALI大鼠，檢測血清TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10 水平的表達，結果發現中、高劑量宣肺止咳合劑和陽性藥能抑制LPS 引起的TNF-α、IL-1、IL-6 水平升高，增加IL-4、IL-10 水平（P＜0.05 或P＜0.01）。

綜上所述，宣肺止咳合劑對內毒素性ALI 的保護作用可能通過調控AQP1 的表達，抑制TNF-α、IL-1、IL-6 等促炎因子，促進IL-10、IL-4 等抗炎因子的釋放，調節促/抗炎平衡來實現的。