DNA 甲基化在風濕性疾病研究進展

姚心怡 陸定其 馮 波 陳麗瑩 何詩雅 王新昌

風濕免疫疾病泛指影響關節、骨骼、肌肉、神經、血管及有關軟組織或結締組織，在遺傳及表觀遺傳學、環境等多種因素共同作用下導致免疫系統功能紊亂的一類自身免疫性疾病。目前對風濕性疾病的發病機制仍缺乏深入認識。風濕性疾病早期診斷困難，精準治療已經成為風濕病疾病治療的遠大前景，雖有一些靶向藥物上市，但仍缺乏廉便有效的根治手段。DNA 甲基化（DNA methylation）作為DNA 化學修飾的一種形式，能通過影響DNA 構象、DNA 穩定性及染色質結構等過程影響基因表達。DNA 甲基化大多發生在基因啟動子區CpG 島上，基因啟動子區的DNA 甲基化可抑制基因轉錄。系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、干燥綜合征（Sjgresyndrome，SS）、類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床最具有代表意義的風濕性疾病，本文就DNA 甲基化在這三種疾病的發病機制、臨床特征以及藥物治療反應三方面的作用，綜述如下。

1 DNA 甲基化

DNA 甲基化是存在于真核細胞中的一種普遍的修飾方式，也是哺乳動物基因表達調控的主要表觀遺傳學形式，其在胚胎發育、染色質重塑、基因轉錄、基因印跡、X 染色體失活等眾多過程中都發揮著關鍵作用。DNA 甲基化是指由DNA 甲基轉移酶（DNA methyl transferase，DNMT）介導，從S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）到CpG 二核苷酸中胞嘧啶殘基的碳5 位置的甲基轉移，生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）的過程。DNA 甲基化過程由DNMT3 建立，并在細胞分裂過程中由DNMT1維持。通常認為基因啟動子區域中的甲基化CpG 位點通過與甲基胞嘧啶結合蛋白（如甲基CpG 結合域蛋白1、甲基CpG 結合域蛋白2 和甲基CpG 結合蛋白2 等）結合而干擾基因轉錄，又稱“基因沉默”，DNA 甲基化可抑制基因轉錄，而DNA 去甲基化則激活基因的表達。10 -11 易位（Ten -Eleven -Translocation，TET）蛋白可將DNA 胞嘧啶5 位碳的甲基氧化生成羥基，從而催化5-mC 羥基化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）[1]。在胸腺嘧啶DNA 糖基化酶（thymine DNA glycosylase，TDG）和去甲基酶的共同作用下，5-hmC 可逆轉5-mC 修飾。此外，甲基化修飾也是蛋白質翻譯后修飾的一種形式，組蛋白的甲基化與去甲基化變化能通過干預染色質結構改變、DNA 的轉錄過程，對炎癥因子的產生、免疫環境的失衡造成影響。組蛋白是負責維持染色質結構的重要蛋白質，并在基因的動態和長期調控中發揮作用。一般認為，組蛋白修飾與基因的激活與抑制均有關系，例如：H3 賴氨酸4（H3 Lysine 4，H3K4）的甲基化是活躍轉錄DNA 的標志，而H3 賴氨酸9（H3 Lysine 9，H3K9）的甲基化與抑制基因表達有關[2]。上述的甲基化修飾方式不改變基因序列而參與調控基因表達，具有一定的穩定性與動態性，因而能使真核細胞生物能在遺傳和環境的共同作用下參與疾病的發生和進展。

2 DNA 甲基化揭示風濕性疾病發病機制

2.1 DNA 甲基化與SLE 發病機制 SLE 是一種可累及全身多系統的慢性難治性自身免疫性疾病，好發于育齡期女性。DNA 甲基化與SLE 疾病發生和維持相關，基因啟動子甲基化被提議作為SLE 的生物標志物[3]。

研究證明，DNA 甲基化抑制藥物如普魯卡因胺、肼丙嗪能誘發野生型小鼠狼瘡樣疾病[4]；幾項全基因組DNA 甲基化研究發現，SLE 患者存在整體DNA甲基化缺陷，且Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）信號相關基因的差異甲基化在SLE 發病中具有重要意義。Busche 等[5]對健康對照和SLE 患者外周血單個核細胞進行全基因組DNA 甲基化分析，發現85%的CpG位點在SLE 中低甲基化，其中幾種主要的IFN 相關基 因 如 下 ：MX1、IFI44L、PARP9、DTX3L、IFI44、PLSCR1、IRF7、IFIT1 和RSAD2。除幼稚CD4+T 細胞外，IFN 相關基因在SLE 患者記憶、幼稚和調節性T細胞中均表現出顯著的低甲基化[6]。另有研究表明，SLE 患者B 細胞中IFN 相關基因低甲基化狀態與早期B-細胞因子1（recombinant early B-cell factor 1，EBF1）重組蛋白結合CpG 位點的作用相關[7]。SLE差異甲基化的基因在先天免疫系統、FasL/CD95L 信號轉導通路、中性粒細胞脫顆粒等生物學過程中富集，差異甲基化基因與風險基因單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）關聯分析發現了7 個與SNPs 關聯的基因座：CD45、MHC-ClassIII、UHRF1BP1、IRF5、IRF7、IKZF3 和 UBE2L3，由此推測SLE 風險位點變異可能通過基因調控區的DNA 甲基化改變來影響疾病表型[8]。

2.2 DNA 甲基化與SS 發病機制 SS 是一種侵犯全身外分泌腺，伴有多系統損害的慢性自身性免疫性疾病。Altorok 等[9]首次報道SS 的表觀基因組關聯研究結果，發現在SS 患者CD4+T 細胞中主要是淋巴毒素α（lymphotoxin-alpha，LTA）和IFN 誘導基因相關位點發生低甲基化，并且編碼溶質載體蛋白的基因如SLC11A1、SLC11A2、SLC22A23、SLC25A25 等也呈現低甲基化狀態。美國俄克拉荷馬大學健康科學中心發現，與SS 最相關的基因遺傳座存在于主要組織相容性復合體/人類白細胞抗原（major histocompatibility complex/human leukocyte antigen，MHC/HLA）區，且與IRF5、BLK、IL12A、TNIP1、CXCR5 等基因密切相關，證明SS 的發病與B 細胞活化、通過IFN 的先天免疫系統激活、HLA 敏感性和IL-12-IFNγ 軸反應相關[10]。與此對應，在Miceli-Richard 等[11]的研究中發現，在SS 患者CD19+B 細胞中IFN 誘導基因位點差異甲基化最為顯著，這也進一步佐證了通過IFN的先天免疫系統的激活是SS 的主要發病機制之一。對SS 患者外周血全基因組DNA 甲基化進行的研究，同樣觀察到IFN 誘導的基因如MX1、IFI44L、PARP9 和IFITM1 等位點存在明顯低甲基化，且TNFRSF10A、IRF8、CXCR5、LTA、SOCS1、TNF、BCL2、PSMB2 和PIK3CD 等基因位點差異甲基化與淋巴瘤有關[12]。Cole 等[13]對SS 患者的唾液腺進行了全基因組DNA 甲基化研究，發現了LTA 基因的低甲基化，這與Altorok 等[9]對外周血全基因組甲基化分析的結論相互印證，提示我們LTA 在SS 發病過程中的潛在作用，LTA 可能是SS 研究的新靶點。

此外，一些針對SS 具體基因位點DNA 甲基化狀態的研究也為我們提供了許多有意義的參考。Yu等[14]發現SS 患者CD4+T 細胞FOXP3 啟動子區CpG位點DNA 甲基化水平顯著增高，且與FOXP3 mRNA 及蛋白表達呈負相關，FOXP3 啟動子區域位點甲基化水平升高可使FOXP3 表達降低，從而促使調節性T 細胞（regulatory cells，Treg）發育受損，進而可能在發病中起重要作用，揭示了細胞免疫與DNA 甲基化的潛在關系。

2.3 DNA 甲基化與RA 發病機制 RA 是一種侵蝕性、進行性破壞關節的慢性系統性疾病。RA 患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、B 細胞、T 細胞等都表現出甲基化狀態的改變[3]。差異基因在T 細胞共刺激、IFN-γ 介導的信號通路和T 細胞受體信號通路等途徑富集，分析蛋白質相互作用后發現了包括MX1、ISG15、IFI44L、DTX3L、PARP9 和STAT3 等在內的干擾素互作網絡，這提示我們同SLE、SS 一樣，IFN 相關基因及通路在RA 發病中也占有較為重要的地位。無獨有偶，Chen 等[15]對RA 患者CD4+T 細胞全基因組DNA 甲基化進行了研究，發現IFN 相關基因如IFIT1、IRF7、MX1、OAS1、USP18、RSAD2 等與對照組相比存在顯著差異甲基化。IRF5 作為干擾素調節因子家族之一，參與了Toll 樣受體信號通路，在急慢性炎癥過程中具有重要作用，IRF5 的單核苷酸多態性與RA 的疾病易感性相關，且在RA 患者中存在IRF5 啟動子區低甲基化狀態[16]，這提示我們IRF5 啟動子區的甲基化狀態可作為RA 的潛在標志物。

除外周血的DNA 甲基化研究外，還有一些研究專注于RA 患者滑膜細胞的DNA 甲基化改變。Ai等[17]對RA 患者成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）的全基因組DNA 甲基化、RNA 轉錄、染色質進行了綜合分析，差異基因提示Huntingtin 信號通路在RA 發病中具有重要作用，并且發現參與網狀蛋白介導的內吞作用和細胞信號轉導的Huntingtin 相互作用蛋白1（huntingtin interacting protein 1，HIP1）能夠調節RA 的FLS 對基質的侵襲。Ham 等[18]發現在RA 患者的滑膜細胞中，差異甲基化基因涉及GLI1、RUNX2 和TFAP2A/C 等，與創傷反應、組織發育、膠原纖維組織和轉化生長因子-β受體信號通路相關。由此可見，DNA 甲基化能夠參與調控RA 靶組織中滑膜細胞的損傷、修復過程，從而影響RA 的疾病發生。

3 DNA 甲基化與風濕性疾病臨床特征

3.1 DNA 甲基化與SLE 臨床特征 SLE 的DNA 甲基化狀態與臨床特征、疾病活動度有關。SLE 具有較高的異質性，在不同種族人群中具有明顯差異。一項將非裔美國人與歐洲裔美國人進行比較的研究確定了原始CD4+T 細胞中DNA 甲基化模式的種族特異性[5]，種族差異的甲基化可能與我們臨床觀察到的SLE 不同種族的發病率、結局和疾病表現的差異有關。DNA 甲基化與SLE 發病的環境因素也密切相關。陽光的照射可誘發SLE 病情活動，暴露在紫外線、香煙煙霧、二氧化硅和其他壓力源等環境中會刺激活性氧的產生，進而通過破壞MAPK/ERK 途徑而導致SLE 患者T 細胞中DNMT1 失調和整體DNA脫甲基[19]。SLE 患者差異甲基化基因如TNK2、DUSP5、MAN1C1、PLEKHA1、IRF7、HIF3A、IFI44 和PRR4 與狼瘡性腎炎相關；IFIT1、IFI44L、MX1、RSAD2、OAS1、EIF2AK2 和RABGAP1L 與更高的疾病活動性和腎臟疾病以及自身抗體的產生有關[20]。同時，狼瘡患者的DNA 甲基化圖譜可以區分不同皮損表現和器官的受累情況[21-23]，如顴部皮疹與盤狀皮疹，腎臟與非腎臟受累，關節與非關節受累等。DNA 甲基化改變與臨床表現的特異性相關，這提示我們特定基因甲基化狀態可能成為診斷標志物和治療的新靶標。

3.2 DNA 甲基化與SS 臨床特征 DNA 甲基化變化與SS 疾病活動和進展、疾病流行和嚴重程度的人群差異相關。研究發現，在抗SSA 和/或抗SSB 抗體陽性的SS 患者中，IFN 誘導基因的低甲基化更明顯[11-12]，并且基因位點的DNA 甲基化水平與ESSDAI 評分密切相關，高ESSDAI 評分患者與低ESSDAI 評分患者相比，DNA 甲基化差異更為顯著。慢性疲勞在具有相同疾病和疾病活動的個體之間差異很大，可能與基因序列或遺傳調控因素發生變化有關。Norheim 等[24]通過研究高疲勞和低疲勞SS 患者的單核苷酸多態性變異來探究DNA 甲基化在SS 患者疲勞中的可能作用，研究發現高疲勞狀態SS 患者與SLC25A40 基因DNA 甲基化水平具有更高的關聯度。Braekke Norheim 等[25]也對此進行了研究，發現高疲勞與低疲勞SS 患者之間的差異甲基化位點，與參與調節免疫應答的活化T 細胞核因子（nuclear factor of activated Tcells，NFAT）、T 淋巴細胞磷脂酶C 及IL-1 通路中參與Nur77 信號傳導的基因相關。這些結果揭示了先天免疫系統和適應性免疫功能與SS 患者疲勞表現具有一定的關聯。Karagianni 等[26]發現，SS患者唾液腺H19 位點印記控制區的DNA 甲基化減少，并與C4 血清補體水平呈負相關，由此我們推測H19ICR 基因DNA 甲基化水平可以作為監測SS 的一個表觀遺傳學標記。

3.3 DNA 甲基化與RA 臨床特征 RA 的疾病過程與環境風險、遺傳風險的疊加作用相關，而DNA 甲基化在其中具有潛在的調節作用。一項基于瑞典RA患者的研究顯示，MHC 區域的cg21325723 位點DNA 低甲基化水平與抗抗環瓜氨酸（anti-cyclic peptide containing citrulline，CCP）抗體陽性RA 發生的風險增加相關[27]。環境風險因素如吸煙等對該位點的DNA 甲基化水平有一定的影響。同時，RA 風險基因位點rs6933349 轉錄水平受到cg21325723 位點DNA 甲基化水平調控。DNA 甲基化的動態變化貫穿RA 疾病過程，與RA 患者疾病活動評分、RA 關節損害評分、sharp 評分、病程等因素相關。研究表明，雙特異性磷酸酶 22（dual -specificity protein phosphatase 22，Dusp22）啟動子區DNA 甲基化水平與RA 患者的糜爛性疾病改變相關；細胞色素P450家族2 亞家族E 成員1（recombinant cytochrome P450 2E1，CYP2E1）啟動子區DNA 甲基化水平與RA 疾病活動度相關[28]。Ai 等[29]對RA 患者膝關節和髖關節的DNA 甲基化進行了研究，發現IL-6 信號傳導途徑相關基因位點存在顯著差異甲基化，且驗證后表明RA 髖關節中IL-6 的表達比膝關節高10.8倍，這提示IL-6 通路相關基因位點的DNA 甲基化水平可能有助于區分RA 的發病部位。

4 DNA 甲基化與風濕性疾病藥物治療反應

DNA 甲基化的動態變化與風濕性疾病的藥物治療反應存在一定關聯。一項混合性結締組織病全基因組DNA 甲基化研究發現，在PARP14、SPATS2L、DDX58、OAS2、PLSCR1、HLA-F、LGALS3B 基因位點上存在與免疫抑制劑治療相關的差異DNA 甲基化表現[30]。另有研究發現，在SLE 患者中存在與糖皮質激素、硫唑嘌呤治療有關的CpG 位點[20]，在腫瘤研究領域，已有部分研究開展對靶向藥物療效與DNA 甲基化相關性的探索，而目前對風濕性疾病治療藥物和DNA 甲基化的研究稍顯不足。就現有的研究結果來看，某些特定基因位點的DNA 甲基化的狀態，可能是預測臨床療效、制定更為合理的治療方案的潛在指標。

5 展 望

風濕性疾病的診斷和治療有效性仍是現階段面臨的難題。各種風濕性疾病獨特的DNA 甲基化圖譜在一定程度上能夠為診斷提供新指標。多種風濕性疾病均存在IFN 相關基因低甲基化這一共性，提示風濕性疾病類似的發病機制，同時調節IFN 相關基因甲基化狀態可能成為未來治療的新思路；基于DNMT 等甲基化相關蛋白作用，我們推測未來使用DNMT 活性調節劑治療風濕性疾病具有一定的可行性；風濕性疾病臨床表現、藥物治療與DNA 甲基化動態變化之間的聯系也為疾病發展、預后和療效預測等方面的研究提供了新參考。目前DNA 甲基化與風濕性疾病的研究有待進一步發展，漢族人群的DNA 甲基化圖譜研究仍相對欠缺，期待在不遠的將來能涌現更多的相關研究，為風濕性疾病的臨床診斷、治療和預后提供更多的表觀遺傳學依據。