滋腎活血方聯合低分子肝素改善小鼠復發性流產及對VEGF/VEGFR-2/p-ERK/ERK 信號通路的影響

葉佳敏 葉利群 張曉芳 楊 脂 沈 穎

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）又稱習慣性流產，指妊娠不滿28 周的胎兒丟失且連續發生3 次或3 次以上，該病病因復雜，機制尚不明確，可能與子宮解剖、內分泌、胚胎染色體、免疫等多種因素有關[1-2]。RSA 屬于中醫學“滑胎”范疇，古今名醫闡述其病因病機不外乎腎虛與血瘀，這與現代醫學對RSA 病理性變化的認識是一致的[3]。據相關文獻闡述，胎盤血管機能異常是導致RSA 發生的最主要病理變化[4]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是治療本病潛在的作用點，VEGF 高表達能夠改善血管重構，促使內膜蛻膜化，最終使胚胎成功植入同時維持妊娠[5-6]。相關研究已證實低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）能提高復發性流產患者VEGF 的表達[7]。前期臨床觀察結果顯示，與單一LMWH 相比，滋腎活血方聯合LMWH 有效改善RSA 患者的妊娠結果[8]。本實驗通過滋腎活血方聯合LMWH 干預RSA 模型小鼠，驗證該法治療RSA 的效果，進一步探討其對VEGF 蛋白介導的信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 68 只未孕CBA/J 雌鼠，26 只DBA/2雄鼠，8 只BALB/c 雄鼠，SPF 級，體質量（20±2）g，鼠齡（7±1）周，購買自北京華阜康生物科技公司，生產許可證號：SCXK（京）2020-0004。飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，室內濕度（50±10）%，室內溫度（23±2）℃，適應性喂養1 周后進行實驗。本研究獲浙江動物倫理委員會批準同意，批件編號：20201019-19。

1.2 實驗用藥及其藥物組成 滋腎活血方：菟絲子、川斷、鹽杜仲、炒黨參、炒谷芽、炒白芍、丹參各15g，炒白術、茯苓、當歸各10g，炙甘草6g，三七粉3g，由寧波市中醫院中藥房煎煮濃縮后備用。煎煮法：用1000mL 純凈水浸泡中藥，先煮沸30min，倒出藥液，按上述方法再次煎藥，將2 次煎藥液混合并減壓濃縮至濃度為2.5g/mL，放置于-10℃冰箱，臨用時加入純凈水稀釋至所需濃度。那屈肝素鈣注射液（0.4mL/4100IUXa 因子，葛蘭素史克有限公司）。

1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司，批號ZLI-9017）；BCA 試劑盒（凱基生物，批號KGP902）；全蛋白提取試劑盒（凱基生物，批號KGP2100）；Tris-EDTA（pH9.0）抗原修復液（上海源葉生物科技有限公司，批號R20904）；免疫組化通用型二抗（北京中杉金橋生物有限公司，批號PV-9001）；兔單克隆VEGF 抗體（Abcam，批號ab214424）；兔單克隆VEGF Receptor 2 抗體（Cell Signaling Technology，批號9698s）；兔單克隆ERK 抗體（Cell Signaling Technology，批號4370t）；兔單克隆P-ERK 抗體（Cell Signaling Technology，批號4695t）；硝酸纖維素膜（Millipore，批號HATF00010）等。

主要儀器：冰凍切片機（Leica 公司，型號Leica CM 1950），隔水式恒溫培養箱（上海甘易公司，型號GNP-9270A），數字切片掃描儀（濱松光子公司，型號NanoZoomer），Odyssey 成像系統（美國LI-COR 公司，型號Odyssey CLx），電泳儀、蛋白轉移系統（美國BIO-RAD 公司，型號mini-PROTEAN、PowerPac），冷凍高速離心機（美國Thermo 公司,型號Fresco 17），制冰機（Panasonic 公司，型號SIM-F140AY65-PC）等。

1.4 造 模 進行適應性喂養7 天后，按雌∶雄=2∶1，每夜將CBA/J 雌鼠分別與DBA/2 雄鼠及BALB/c 雄鼠同籠交配。依據文獻[9]的經典方法，將流產率僅有5%～10%的CBA/J×BALB/c 交配方式作為正常妊娠模型小鼠，流產率高達30%～40%，且具有隱形、反復性及父系特異性特征的CBA/J×DBA/2 交配方式作為反復流產小鼠模型。取雌鼠陰道分泌物制作成涂片，若檢出雌鼠有脫落的陰栓（乳白色、固態膠狀物）或鏡下發現含有大量精子的陰道涂片，則記為妊娠第0 天。

1.5 分組與干預 將建模成功后的正常妊娠小鼠10 只作為正常對照組，RSA 模型小鼠50 只按隨機數字法分為模型組、LMWH 組、滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組，每組10 只。

從妊娠期第1d 開始，每日上午7 點給藥，通過人鼠等效劑量比值表（以人鼠體表面積折算）計算出用藥劑量[10]，LMWH 組按1000U/kg 在小鼠腹腔內注射；正常對照組及模型組灌胃等體積蒸餾水；滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組，中藥灌胃劑量分別為3.9、11.7、35.1g/kg，LMWH 與西藥組同劑量，給藥2 周。

1.6 標本收集 末次給藥1d 后，每只小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛（1mL/100g），麻醉后用脊椎脫臼法處死，解剖并分離子宮，縱向剖開子宮，每只小鼠取4個不同部位的蛻膜組織固定在4%多聚甲醛液中，20min 后將組織內含有水分脫去，用石蠟滲透進行包埋、制成切片備用。

1.7 觀察指標

1.7.1 小鼠流產率 觀察小鼠宮腔內胚胎表現，并計算胚胎丟失率。判斷依據：正常胚胎（淡紅、均勻粗大似串珠），宮內未有積血；流產胚胎局部顯露或全部丟失（黑褐、大小不均或竹節樣變），宮內有大量積血。

胚胎丟失率=流產胚胎數/（存活胚胎數+流產胚胎數）×100%。

1.7.2 免疫組化法檢測蛻膜組織中VEGF 表達 每組蛻膜組織切片脫蠟至水，加入3%H2O2靜置20min，PBS 液沖洗5min 后微波爐抗原修復，放置于10%山羊血清中密封處理0.5h，隔日PBS 液沖洗后滴入VEGF 一抗工作液（稀釋倍數為1∶100），36℃靜置1h，PBS 液沖洗5min，滴入生物素標記的二抗工作液，同等溫度下靜置0.5h，再次PBS 液沖洗5min，DAB 染色，復染，脫水，采用中性樹脂密封保存，借助光學顯微鏡，鏡下若有棕色或黃色的顆粒在細胞胞漿或胞核內顯現則該反應陽性。用ImageJ 顯微圖象分析系統，剖析同一視野下免疫反應陽性細胞的積分光密度（IOD）值，該值越大，提示蛋白表達越高。

1.7.3 Western blot 測定VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 通路相關蛋白表達 每組蛻膜組織剪取約100mg，由液氮處理后，按照全蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白。通過BCA 法對蛋白濃度進行測量，取離心后的上清液中總蛋白20μg，于10%SDS-PAGE電泳分離后移至硝酸纖維素膜上。將該膜置于含5%脫脂奶粉的PBS-T 中室溫封閉2h，然后分別加VEGF、p-ERK（稀釋倍數1∶1000），VEGFR-2、ERK抗體（稀釋倍數1∶500）一抗，4℃孵育，次日滴加TBST沖洗3 次，每次10min。用二抗稀釋液以1∶10000 稀釋辣根過氧化物酶封閉2h，再加TBST 沖洗3 次，每次10min。采用ImageJ 軟件定量蛋白灰度值，蛋白相對表達水平用目的蛋白與GAPDH 蛋白的灰度比值表示。

1.8 統計學方法 應用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，所有符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 方法，計數資料比較，采用χ2檢驗。按P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠胚胎丟失率 與正常對照組比較，模型組小鼠胚胎丟失率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，LMWH 組、滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組小鼠胚胎丟失率均明顯下降（P＜0.05）；與LMWH 組比較，滋腎活血方低劑量+LMWH 組小鼠胚胎丟失率下降，但差異無統計學意義（P＞0.05），滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組胚胎丟失率明顯下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠胚胎丟失率比較

2.2 各組小鼠蛻膜組織VEGF 表達 免疫組化結果表明，與正常對照組比較，VEGF 蛋白平均IOD 值在模型組降低顯著（P＜0.01）；與模型組比較，該平均值在LMWH 組、滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH組均有不同程度上升（P＜0.05）；與LMWH 組比，在滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組中該平均值均有不同程度上升，均有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 各組小鼠蛻膜組織VEGF 平均光密度比較（）

表2 各組小鼠蛻膜組織VEGF 平均光密度比較（）

注：正常對照組灌胃蒸餾水；模型組灌胃蒸餾水；LMWH 組腹腔內按1000U/kg 注射LMWH；滋腎活血方低劑量+LMWH 組按3.9g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH；滋腎活血方中劑量+LMWH組按11.7g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH；滋腎活血方高劑量+LMWH 組按35.1g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH；VEGF 為血管內皮生長因子；LMWH 為低分子肝素；與正常對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05；與LMWH 組比較，cP<0.05

圖1 各組小鼠蛻膜組織VEGF 蛋白表達（免疫組化染色，×100）

2.3 各組小鼠蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 通路相關蛋白表達 Western blot 結果表明，與正常對照組比較，VEGF、VEGFR-2 蛋白在模型組降低（P＜0.05）；與模型組比較，VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 蛋白在LMWH 組、滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組均有不同程度上升（P＜0.05）；與LMWH 組相比，VEGFR-2、p-ERK、ERK 蛋白在滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組均有不同程度上升，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 各組小鼠蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 蛋白的表達

表3 各組VEGF、VEGFR-2、ERK 與p-ERK 蛋白灰度值比較（）

表3 各組VEGF、VEGFR-2、ERK 與p-ERK 蛋白灰度值比較（）

注：正常對照組灌胃蒸餾水；模型組灌胃蒸餾水；LMWH 組腹腔內按1000U/kg 注射LMWH；滋腎活血方低劑量+LMWH 組按3.9g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH；滋腎活血方中劑量+LMWH 組按11.7g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH；滋腎活血方高劑量+LMWH 組按35.1g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH；VEGF 為血管內皮生長因子；VEGFR-2 為血管內皮生長因子受體2；p-ERK為磷酸化的細胞外調節蛋白激酶；ERK 為細胞外調節蛋白激酶；LMWH 為低分子肝素；與正常對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與LMWH 組比較，cP<0.05

3 討論

隨著對RSA 病機的深入挖掘，大多數學者認為母胎界面脈管新生障礙是導致RSA 發生的重要因素[11]。從妊娠生理來看，胚胎的著床伴隨著子宮內膜蛻膜化，在這變化中大量的血管生成與重塑使胚胎與子宮內膜緊密結合，建立豐富的子宮-胎盤血管網以便母胎間物質運輸，確保正常妊娠進行[12]。若胎盤組織中血管生成受阻，胚胎難以植入或使胎兒血供不足，皆為妊娠失敗，是目前RSA 重要發病機制。中醫認為，“滑胎”的病因病機以腎氣虛弱為本，瘀血停滯為標。腎主生殖，藏精，《女科經綸》謂腎氣為“母之真氣”，“子所系”，故腎氣充盛乃維持正常妊娠及促進胎兒生長之根本。據《黃帝內經·靈樞》載：“有所墜墮，惡血內留”，可見瘀血為“墜墮”的重要影響因素。腎虛與血瘀貫穿于本病之始終，當以滋腎活血安胎為大法。

清末醫家張錫純主張本病從腎論治，獨創壽胎丸防治滑胎，為補腎固沖安胎之劑，臨床屢獲效驗。滋腎活血方以壽胎丸為基礎，輔以活血、健脾之品，方中菟絲子為君藥，補腎固胎；續斷、杜仲補肝腎、通血脈、安胎元，兩藥助君補腎止漏安胎；黨參、炒白術、茯苓、炒谷芽、炙甘草補脾益胃，以后天生先天，充腎臟之精氣；白芍養血緩急；三七、當歸、丹參皆為活血祛瘀之品，合用活血之效倍增。在現代藥理學中，三七中的三七皂苷、當歸中的阿魏酸、丹參中的丹酚酸B 均有降低血液的黏稠度、減低血小板聚集及血栓生成，改善微循環的功能[13-15]。諸藥合用，補腎固沖，祛瘀生新，保證了胎盤及胎兒的血液供給，印證了《黃帝內經》中“有故無殞，亦無殞也”之意。

VEGF 是子宮血管生成最重要的調節因子。有研究表明，VEGF 的血管新生作用與活血化瘀法之“生新脈”作用機制是一致的[16]。在妊娠早期，VEGF 的“生新脈”作用，可促進子宮內母胎血管系統的形成，提高子宮內膜容受性，促進胚胎著床[17]。所以提高VEGF 的水平成為改善RSA 患者母胎界面血管重構的切入點。

在本研究中發現，滋腎活血方+LMWH 組較單用LMWH 組小鼠胚胎丟失率顯著降低，蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 通路相關蛋白表達明顯升高，通過本研究可以推測出滋腎活血方聯合LMWH 可通過VEGF 介導的信號通路改善RSA 小鼠妊娠結局。VEGFR-2 是VEGF 的特異性受體，它介導與血管生成有關的信號傳導優于其它受體，是因其高酪氨酸激酶活性[18-19]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路位于VEGFR-2 的下游，共同參與子宮內膜的血管生成。MAPK 家族里最重要的ERK，其磷酸化后形成的p-ERK 才具有活性，能夠促進某些基因的轉錄和表達[20]。VEGF 與VEGFR-2 相結合后，激活其下游的MAPK 信號通路（即PLC-γ-PKC-Raf-MEK-ERK 信號通路），p-ERK 被迅速地轉送到細胞核中去磷酸化并激活相應增殖反應的轉錄分子，調控細胞核內基因轉錄，促使血管內皮細胞增殖，有利于胚胎植入子宮內膜，形成良好母胎界面血管系統，促進妊娠進程，最終影響胚胎發育[21]。

綜上所述，滋腎活血方聯合LMWH 可上調RSA模型小鼠蛻膜組織VEGF 及VEGFR-2 的表達，這與激活VEGF/VEGFR-2/p-ERK/ERK 信號轉導通路密切相關，本研究結果或為中西醫結合療法改善RSA患者妊娠結局提供實驗基礎。