miR-378 通過(guò)靶向RAB11A 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系增殖和遷移

凌 晨 盧 毓 方珍裕 陸曉磊 張葉飛

乳腺癌是最常見(jiàn)的癌癥類型之一，也是全世界女性癌癥相關(guān)死亡率較高的主要原因[1-2]。近年來(lái)乳腺癌患者預(yù)后有所改善，但5 年生存率一直較低，主要因?yàn)槿橄侔┘?xì)胞具有惡性增殖和轉(zhuǎn)移的特征[3-5]。MicroRNAs（miRNAs）是一類微小的非編碼RNA，可以通過(guò)靶向特點(diǎn)的mRNAs 參與調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程。據(jù)報(bào)道，miRNA 在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用，有望成為乳腺癌治療的靶點(diǎn)[6-7]。由于miRNAs在疾病中特異性表達(dá)，越來(lái)越多的研究表明，miRNAs 可能是一類理想的癌癥早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[8-12]。miR-378 在乳腺癌中的表達(dá)和作用機(jī)制尚待研究確定。本研究通過(guò)targetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)RAB11A 的3’UTR 上miR-378 的結(jié)合位點(diǎn)，探討miR-378 可能通過(guò)靶向RAB11A 抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

1 材料與方法

1.1 細(xì) 胞 人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7 和MDA-MB-231）購(gòu)于上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物和試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco 公司，批號(hào)1897365、9001-108）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Thermo，批號(hào)11668-019）；MiR-378-inhibitor，對(duì)照組（廣州銳博，批號(hào)20210203081519）；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（碧云天，批號(hào)P009）。miRNA 提取試劑盒（Qingen，批號(hào)217004）。RAB11A抗體（Abcam，批號(hào)ab65200）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，批號(hào)RR036A）。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（碧云天，批號(hào)RG008）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A 采用包含1%胎牛血清（FBS）、100mg/mL青霉素、100mg/mL 鏈霉素的高糖培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。無(wú)菌超凈工作臺(tái)進(jìn)行試驗(yàn)操作，3d 傳代1 次，在第2 代細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行鋪6 孔細(xì)胞板，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組：miR-378-inhibitor 組，對(duì)照（NC）組。采用Lipofectamine 2000 將轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞中。放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞RNA 的提取及實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）收集細(xì)胞后，用PBS 清洗2 次，采用Trizol 試劑提取細(xì)胞中的RNA。進(jìn)一步檢測(cè)RNA 的濃度，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒試驗(yàn)操作步驟進(jìn)行cDNA 合成實(shí)驗(yàn)。miR-378 和RAB11A 的mRNA 檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，總計(jì)40 個(gè)循環(huán)。統(tǒng)計(jì)Ct 值，用2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 細(xì)胞蛋白提取及Western blot 檢測(cè) 用BCA法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解和蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)（25μg/lane）用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）。用一抗體孵育聚偏二氟乙烯（PVDF）膜與RAS 癌基因家族成員11A（RAB11A）（稀釋1∶600）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（稀釋1∶800）在37℃下保持30min。然后用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（H+L）二級(jí)抗體孵育PVDF 膜。使用ImageJ 1.47 軟件（美國(guó)馬里蘭州貝塞斯達(dá)國(guó)立衛(wèi)生研究院）對(duì)譜帶強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種于96 孔板中，每孔加入4000 個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，48h，72h，96h 時(shí)加入CCK-8 試劑10μL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱1h 后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（OD）。繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移 轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種于Transwell 小室的上室200μL DMEM，下室加高濃度FBS 的DMEM 培養(yǎng)基550mL。隨后將放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。取出小室，用棉簽清除小室內(nèi)未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，然后把小室放室溫干燥，在室溫下用10%甲醛固定30min，用0.5%結(jié)晶紫染色。用倒置顯微鏡隨機(jī)選擇視野拍照（日本大津尼康公司）放大100 倍。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 使用TargetScan Human7.2 軟件搜索miR-378 的靶基因。為了確定RAB11A 是否是miR-378 的直接靶基因，我們進(jìn)行了熒光素酶檢測(cè)。將MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞接種于24 孔板中，培養(yǎng)至70%融合。然后用miR-378 inhibitor 和對(duì)照NC 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在37℃孵育48h后，收獲細(xì)胞用雙熒光素酶測(cè)定熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 上述實(shí)驗(yàn)操作均重復(fù)3 次。應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞miR-378 和RAB11A mRNA 表達(dá)水平變化 與正常乳腺細(xì)胞MCF-10A 比較，乳腺癌細(xì)胞系（MCF、MDA-MB-231）miR-378 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平顯著增加，RAB11A mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 MCF-10A，MCF-7，MDA-MB-231 細(xì)胞miR-378和RAB11A mRNA 表達(dá)水平（）

表1 MCF-10A，MCF-7，MDA-MB-231 細(xì)胞miR-378和RAB11A mRNA 表達(dá)水平（）

注：miR-378 為微小RNA-378；RAB11A 為RAS 癌基因家族成員11A；與MCF-10A 相比，aP＜0.01

2.2 乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor 后進(jìn)行RT-PCR 驗(yàn)證 在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor 后，MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞miR-378表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。RAB11A mRNA 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組miR-378 和RAB11A mRNA 表達(dá)水平（）

表2 各組miR-378 和RAB11A mRNA 表達(dá)水平（）

注：miR-378 inhibitor 為miR-378 抑制物，NC 為negative control 陰性對(duì)照；與NC 相比，aP＜0.01

2.3 miR-378 inhibitor 對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響在MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor 后，第3、4 天后，與對(duì)照組比較，miR-378 inhibitor 顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間各組的細(xì)胞活性分析（）

表3 不同時(shí)間各組的細(xì)胞活性分析（）

注：miR-378 inhibitor 為miR-378 抑制物；NC 為為陰性對(duì)照；與NC相比，aP＜0.01

2.4 miR-378 inhibitor 對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響在MCF-7 和MDA-MB-231 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor 后，與對(duì)照組比較，miR-378 inhibitor 顯著抑制了乳腺癌細(xì)胞的遷移（P＜0.01）。見(jiàn)表4、圖1。

圖1 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移變化（放大倍數(shù)，×100）注：miR-378 inhibitor 為miR-378 抑制物；NC 為陰性對(duì)照

表4 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移變化

2.5 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-378 的靶基因RAB11A 利用TargetScan 軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-378的可能靶基因是RAB11A。為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-378 與RAB11A 之間的關(guān)系，我們轉(zhuǎn)染miR-378 inhibiotor，通過(guò)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-378 inhibitor 可以顯著增加RAB11A 的表達(dá)（見(jiàn)圖2，表5）（P＜0.01）。進(jìn)一步熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor 后，熒光素酶活性增強(qiáng)（P＜0.01），見(jiàn)表5。

圖2 Western bolt 檢測(cè)RAB11A 蛋白表達(dá)（轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor 后）

表5 各組蛋白表達(dá)水平和熒光素酶活性（）

表5 各組蛋白表達(dá)水平和熒光素酶活性（）

注：miR-378 inhibitor 為miR-378 抑制物；NC 為陰性對(duì)照。與NC 相比，aP＜0.01

3 討論

乳腺癌是常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，其近幾年的發(fā)病率和死亡率不斷增加[13-14]。乳腺癌主要發(fā)病因素由遺傳和環(huán)境兩個(gè)方面共同引起。此前有報(bào)道稱異常表達(dá)的miRNAs 在人類多種疾病中發(fā)揮重要作用，包括炎癥性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、發(fā)育障礙和腫瘤等[15]。多項(xiàng)研究表明，異常表達(dá)的miRNA 可作為腫瘤抑制因子或致癌因子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移和轉(zhuǎn)移[16]。

表6 各組熒光素酶活性（）

表6 各組熒光素酶活性（）

注：miR-378 inhibitor 為miR-378 抑制物；NC 為陰性對(duì)照；與NC 相比，aP＜0.01

miR-378 是微小RNA 家族的重要成員之一，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中可作為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。先前基于體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究表明，在非小細(xì)胞肺癌和慢性髓系白血病細(xì)胞中miR-378 促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和血管生長(zhǎng)[17]。宮頸癌組織和細(xì)胞miR-378 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)遷移與侵襲，并與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在卵巢癌中，miR-378 表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)高低于無(wú)進(jìn)展生存率相關(guān)[18]。然而，與所有這些結(jié)果相反，在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)高miR-378 表達(dá)水平與腫瘤大小的顯著減小相關(guān)，這表明miR-378 可能通過(guò)減少增殖、遷移和侵襲而發(fā)揮腫瘤抑制作用[19]。在結(jié)直腸癌中檢測(cè)到miR-378 下調(diào)，低表達(dá)被確定為結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立不利預(yù)后因素[20]。對(duì)不同癌細(xì)胞系（包括結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞）的功能研究表明，miR-378 上調(diào)還可促進(jìn)腫瘤抑制特性，如減少細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和增加凋亡[21]。總之，miR-378 在不同類型的癌癥中可能具有不同促進(jìn)或抑制作用。本文研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中miR-378 表達(dá)顯著升高，其余乳腺癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

在乳腺癌中miR-378 的表達(dá)顯著升高，但是其在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用仍需要闡明。目前，國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-378 在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，通過(guò)ST7L/Wnt 信號(hào)通過(guò)發(fā)揮調(diào)控作用，敲降miR-378 的表達(dá)可能是治療宮頸癌的新方法[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-378 通過(guò)靶向ATG2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，從而發(fā)揮癌基因的功能[22]。本研究中，在MCF-7、MDA-MB-231 細(xì)胞中敲降miR-378 后，乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力與對(duì)照組相比被顯著抑制。利用TargetScan 軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-378的可能靶基因是RAB11A。為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-378 與RAB11A 之間的關(guān)系，熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-378 inhibitor 后，熒光素酶活性增強(qiáng)。因此，miR-378 通過(guò)靶向RAB11A 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-378 在乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231 中表達(dá)上調(diào)，RAB11A 在乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231 中表達(dá)下調(diào)，抑制miR-378可以減少乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移，在乳腺癌細(xì)胞中miR-378 靶向RAB11A。因此，抑制miR-378 的藥物就有可能在乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移中起到重要的作用，可能抑制BC 的增殖和遷移，從而提高BC 的治愈率。