醬香型白酒發酵過程中微生物多樣性研究進展

李巧玉，譚方根，焦 富，牟明月

（貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564501）

白酒是中華民族具有傳統特色的飲料酒，主要采用糧谷等為原料，以酒曲、活性干酵母等為糖化發酵劑，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾、貯存、勾兌而成，其獨特的生產工藝和風味特征使得其在國際上也享有較高聲譽，為世界六大蒸餾酒之一。同時，因釀造原料、生產工藝及自然環境等因素的不同，導致參與釀造過程的微生物菌群結構不同，最終形成了各具風格特色的12種不同香型。

“曲乃酒之魂”，大曲作為發酵劑為白酒發酵過程提供豐富的微生物及酶系，酒醅中微生物群落的結構穩定及其生長、代謝對白酒風味形成起著重要的作用。目前，各研究者針對中國白酒釀造中微生物多樣性、固態發酵工藝的復雜性和風味化合物的豐富性這3 個典型特征，基于風味導向技術對中國白酒微生物發酵特征及代謝風味物質調控進行了研究，將對白酒的研究從傳統微生物學研究深入到分子微生物學層面，從經驗型的操作應用提升到風味導向下的微生物定向代謝風味品質調控的微生物代謝組學層面。細菌作為醬香白酒主要微生物類群之一，是發酵生香的動力來源，酵母直接關系到產酒率，且能夠代謝產生大量不同的風味物質，對醬香型白酒風格的形成具有重要作用。大曲及酒醅中的微生物直接參與了醬香型白酒風味物質的形成，因此微生物菌群的種類及數量對白酒風味及香型形成極其重要，本文基于此對醬香型白酒發酵過程中的微生物多樣性進行研究方法綜述，為進一步從微生物的角度理解醬香型白酒的發酵機理提供參考。

1 微生物多樣性研究方法進展

1.1 微生物傳統培養法

傳統微生物培養法是根據目標微生物對碳源、氮源、生長因子等不同營養物質的需求，在培養基中加入相應比例的營養成分，進行定時定溫培養，然后通過形態觀察，并結合生理生化特征等進行鑒定，分析不同可培養微生物的種類和數量。王曉丹等利用傳統微生物培養法從醬香型白酒酒醅中分離篩選得到和，通過純培養研究得出上述兩株菌分別具有產乙酸乙酯和產乙酸苯乙酯的功能。傳統微生物培養法有利于了解分離純化得到的微生物的形態特征和生理特性，對有價值的微生物進行保藏、應用等，但該方法在實際應用中工作量大、流程繁瑣，且人工模擬的環境與醬香型白酒發酵過程中微生物的生長環境存在一定偏差，僅對占微生物總數0.1 %～10 %的可培養微生物進行分析，不能準確反映微生物在自然狀態下的群落組成、分布及變化特征。

1.2 微生物免培養法

1.2.1 化學的非培養方法

化學的非培養方法就是指非培養的生理生化方法。這種方法的實現主要有兩種，一種是脂肪酸甲酯與磷脂脂肪酸分析法，另一種是由美國Biolog公司開發出Biolog 法。脂肪酸甲酯與磷脂脂肪酸分析法基于微生物的組成中存在的磷酸。磷酸是微生物細胞膜的重要組成成分，具有特異性，因此人們可以用放射性元素對微生物的細胞膜進行標記，然后分析提取出含有標記物的磷酸，進而分析得知此種微生物在取樣環境中的分布與含量。Biolog 法的原理是在微平板上的反應孔中有不同碳源和四唑鹽染料，微生物在利用碳源的過程中產生自由電子，與染料發生還原顯色反應，顏色的深淺可反映微生物對碳源利用能力的差異，以此鑒定純種微生物或比較分析不同的微生物群落，具有直觀、快捷的特點，因此常用于微生物分類鑒定分析。化學非培法相比較傳統的微生物培養分析手段，能較為全面的分析體系中可培養和不可培養微生物，并且更詳盡地反映微生物的變化和波動情況，但因涉及的化學試劑較多，對環境及樣品的影響較大，常用于院校或科研機構對微生物多樣性的研究，較少應用于食品生產過程在制品分析。為使微生物鑒定從一般表型特征的鑒定，深化到遺傳特性的鑒定，研究者在傳統的微生物實驗鑒定技術的基礎之上，利用基因序列同源性分析，建立一種客觀、靈敏、快速的微生物多樣研究方法。

1.2.2 基因指紋圖譜分析法

隨著DNA 提取技術、聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術的不斷發展，分子生物學技術越來越廣泛地應用于微生態學的研究，為發酵食品微生物群落多樣性的研究帶來了良好的契機。基因指紋圖譜技術是基于核酸分子成分、大小和構型上的差異，利用電泳方法將不同的核酸分子分離，形成不同分子量的基因條帶圖譜，根據圖譜上條帶信息進行基因分析的技術。基因條帶圖譜中，每個條帶代表不同的操作分類單位（Operational Taxonomy Unit，OTU），條帶數量反映微生物種群的多樣性和相對豐度。原核微生物多樣性分析以核糖體基因序列（Ribosomal gene sequences，rRNA）為研究對象，16S rRNA 基因具有高度的保守性和高變異性，保守性能夠反映生物物種的親緣關系，高變異性則能反映生物物種特征核酸序列的差異性，擁有豐富的數據庫等優點。真核微生物多樣性研究主要基于18S rRNA 基因、26S rRNA 基因和5.8S rRNA 間隔區（ITS 間隔區）的擴增和分析。王莉等通過擴增醬香型白酒窖底泥樣本中細菌16S rDNA 的V6 區并采用Illumina高通量測序平臺進行深度測序發現，隨著窖底泥的不斷馴化，、和等厭氧微生物逐漸成為主要優勢種群。目前，基因指紋圖譜技術在發酵食品微生物多樣性分析中應用較廣泛。

1.2.3 宏基因組學

宏基因組學（Metagenome）又稱元基因組學、環境（生態）基因組學、群落基因組學，是一種不依賴于人工分離培養的微生物基因組技術。Handelsman 等將宏基因組學定義為：以某一特定環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、尋找新基因、相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法。宏基因組學研究常采用穩定同位素探針技術（Stable isotope probe technique，SIP）實現目的基因組的富集，根據樣品的類型制定相應的DNA 或RNA 提取方法，研究者發現疊氮溴化乙錠（Ethidium Monoazide Bromide，EMA）或疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA）中的疊氮化物基團被光解并發生C—H 插入反應可與DNA形成共價鍵，從而產生永久性的DNA 修飾。EMA和PMA 無法通過功能完整的細胞膜，僅能與暴露的DNA 相結合，因此可用來選擇性地修飾來自死亡細胞的暴露DNA，同時保留來自活細胞的完整DNA，從而去除環境樣品群落中死亡微生物的DNA，達到高效提取高質量基因組的目的。構建的基因組文庫可根據活性物質進行功能篩選，或根據已知序列設計特異性PCR引物、雜交探針進行序列分析篩選，通過宏基因組測定對待研究樣品的功能進行分析。宏基因組技術的發展，為研究白酒釀造微生物多樣性提供了新的方法和手段。目前，宏基因組學技術因解析微生物種群間的相互協作作用，常應用于發掘白酒大曲微生物資源及大曲酒生產相關酶類（淀粉酶、酯酶、蛋白酶、脂肪酶、氧化還原酶等新功能酶）的研究，為新功能酶類應用于大曲酒釀造過程中提供技術支撐。

2 醬香型白酒發酵過程中微生物多樣性研究進展

2.1 細菌多樣性

高溫大曲作為醬香型白酒發酵劑，其中原核微生物種屬較多，主要是由、和等菌群構成，菌株在發酵過程中利用原料生成大量的呈香呈味物質及其前體。呂錫斌等通過高通量測序技術分析醬香型白酒下造沙輪次的微生物多樣性發現：下沙、造沙輪次分別檢測到203 個、184 個細菌屬。下沙輪次發酵過程中主要細菌屬為、、、、，其中豐度最高；造沙輪次發酵過程中主要細菌屬為、、、、、、，其中豐度最高。胡小霞等利用高通量測序等方法分析了醬香白酒一輪次堆積和窖池發酵酒醅中的細菌菌群結構，結果顯示，堆積發酵過程中、和占主要優勢。黃蘊利等采用高通量測序技術解析了醬香型白酒二輪次發酵過程中微生物群落結構的變化、微生物多樣性以及物種與樣品之間的關系，結果表明，堆積過程中絕對優勢細菌屬有、、、，在窖內發酵酒醅中絕對優勢細菌屬為。醬香型白酒釀造過程中優勢細菌屬見表1。

表1 醬香型白酒釀造過程中優勢細菌屬

2.2 真菌多樣性

大曲中的真核微生物主要是和。主要有和等；主要是（、、）、（、、、）、、、等；呂錫斌等通過高通量測序技術分析醬香型白酒下造沙輪次的微生物多樣性發現：下沙、造沙輪次分別檢測到160 個、109個真菌屬。在下沙輪次發酵過程中主要真菌屬為、、、、，其中豐度最高；造沙輪次主要真菌屬為、、、、。黃蘊利等采用高通量測序技術解析了醬香型白酒二輪次發酵過程中微生物群落結構的變化、微生物多樣性以及物種與樣品之間的關系，結果表明，堆積過程中絕對優勢真菌屬有、、、；在窖池發酵酒醅中絕對優勢真菌屬為、、、。郭敏等通過高通量測序技術分析醬香型白酒三輪次微生物多樣性發現，、、、是醬香型白酒發酵過程絕對優勢的真菌微生物屬。醬香型白酒釀造過程中優勢真菌屬見表2。

表2 醬香型白酒釀造過程中優勢真菌屬

2.3 微生物種群間的相互作用與影響

種群是微生物的基本生存單位，執行相關代謝功能的種群組合在一起形成了微生物系統。醬香型白酒所采用的糖化發酵劑主要由高溫大曲組成，曲所帶入的微生物種群不同，加之開放式的生產工藝，釀造環境中微生物必將進入發酵體系，從而形成了釀造微生物的多樣性與復雜性。經過多年的實踐與探索，范光先等認為，醬香型釀造微生物區系平衡的研究成果對醬香型白酒釀造工藝有著指導意義。陳筆等研究發現，和是醬香型白酒發酵過程的優勢霉菌，將XJ10 與混合發酵，最終發酵液中的釀酒酵母的生物量以及乙醇產量，酯類、醛酮類、乙酸乙酯等風味物質濃度均有不同程度的增加。許焰等將來源于茅臺醬香型白酒酒醅的4 種菌株CGMCC4745、CCTCCM2014463、CGMCC3962 及共培養發現的生長受到的抑制作用，但幾乎不受及的抑制，分析原因可能為產生的乙醇、有毒化合物或者營養競爭作用抑制了的生長。在醬香型白酒發酵過程中微生物種群間相互作用，導致代謝產物的多樣性與復雜性，給研究帶來很大的困難，通過實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）技術實現系統中微生物的原位分析，認識微生物結構與功能的關系，通過調控種群結構達到系統功能的最佳狀態，從而建立適用于中國白酒微生物菌群研究的新方法。

3 展望

白酒釀造微生物多樣性的研究，多年來一直是行業熱點，但是對于微生物群落和多酶體的整體認識是片面的，影響行業人士對微生物代謝機理及功能性成分的系統認識。采用高通量測序技術，解析白酒釀造發酵過程中微生物的群落演替及相互作用，同時借助代謝組學對微生物代謝產量進行定性、定量分析，并結合統計學和生物信息學分析方法建立微生物與功能物質的相關性研究，進一步探究醬香型白酒的呈香呈味機理，對于企業理論結合實際指導生產具有極其重要的意義。結合研究發現可在提取宏基因組的過程中加入EMA 或者PMA，以選擇性地去除環境樣品群落中死亡微生物的DNA，同時保留來自活細胞的完整DNA，達到高效提取高質量基因組的目的，保證定量分析的準確性。利用EMA 或者PMA 進行熒光定量PCR解析醬香型白酒發酵過程中大曲、酒醅、窖泥等機制中微生物組成結構，結合微生物的相互作用分析，對于研究醬香型白酒發酵機制和呈香機理具有十分重要的意義。