基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探析淫羊藿-牛膝藥對治療股骨頭壞死的作用機制*

石 威，張俊忠，解鵬超，侯 燕，余 昕，李 磊，姜紅江，，△

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230000；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)；3 濱州市中醫(yī)醫(yī)院；4 山東省文登整骨醫(yī)院

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是由于不同因素破壞了股骨頭的血液供給，導(dǎo)致股骨頭發(fā)生局部或完全性缺血，使股骨頭微觀結(jié)構(gòu)如骨細胞、骨髓造血細胞及脂肪細胞壞死，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷的病理過程，是骨科最常見的臨床疑難疾病［1］。常見的類型有激素性O(shè)NFH、酒精性O(shè)NFH 和外傷性O(shè)NFH。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，該病多見于30～50 歲的中青年人群，我國ONFH 患者已有近800 萬人，且近年來本病的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，每年新增約15～20 萬病例［2-3］。該病具有極高的致殘率，已經(jīng)嚴重危害了患者的生命健康并降低了患者的生活質(zhì)量［4］。

中醫(yī)學(xué)將ONFH 歸屬為“骨蝕”“骨痿”的范疇，認為ONFH 與肝腎虧虛、經(jīng)脈瘀阻密切相關(guān)，總體治療原則以補益肝腎、強筋健骨、活血化瘀為主［5］。中藥治療ONFH 有療效確切、安全性高的優(yōu)勢，對ONFH 的防治具有很好的效果，在ONFH 的保髖治療中起到了至關(guān)重要的作用［6］。淫羊藿是小檗科淫羊藿屬植物，主要功效為補腎壯陽、祛風(fēng)除濕、強筋健骨。藥理學(xué)研究［7-8］表明，淫羊藿具有抗炎、舒張血管、免疫抑制、抗氧化以等作用。牛膝屬于莧科牛膝屬植物，主要功效為活血通經(jīng)、補肝腎強筋骨、引火下行。藥理學(xué)研究證明，牛膝具有促進血管內(nèi)皮細胞生長、促進成骨細胞分化、預(yù)防凝血等作用［9-11］。結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用，淫羊藿、牛膝相須配對使用符合臨床防治ONFH 的理念，但對其作用機制尚不明確，因此有必要進一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥理學(xué)融合醫(yī)學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計算機科學(xué)等多學(xué)科而形成的一門新學(xué)科，能夠全面地反應(yīng)藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的分子作用機制［12］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，從淫羊藿、牛膝的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，深入挖掘淫羊藿-牛膝藥對調(diào)治ONFH 的關(guān)鍵靶點和潛在的分子作用機制并進行分子對接驗證，以期更好的為治療ONFH 的臨床用藥提供一定的理論參考，同時為新藥的研發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 淫羊藿-牛膝藥對相關(guān)靶點篩選通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫［13］檢索中藥淫羊藿、牛膝化學(xué)成分，根據(jù)藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性指數(shù)（drug-likeness，DL）≥0.18［14］兩個ADME屬性值對活性成分進行初步篩選以獲取活性化合物后查找藥物作用的有效蛋白質(zhì)靶點。

1.2 淫羊藿-牛膝藥對“活性成分——靶點”網(wǎng)絡(luò)篩選完蛋白質(zhì)靶點后，利用Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org）為化合物作用的蛋白質(zhì)靶點信息進行標準化，使用Cytoscape 3.8.0［15］構(gòu)建淫羊藿-牛膝“活性成分——靶點”網(wǎng)絡(luò)并探究兩者的關(guān)系。

1.3 ONFH 相關(guān)靶點檢索通過檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫［16］（http：//www.omim.org）、GeneCards數(shù)據(jù)庫［17］（http：//genecards.org）中ONFH 的潛在靶點，結(jié)合DRUGBANK數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）挖掘治療ONFH的臨床藥物作用靶點［18］。合并3個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復(fù)值得到ONFH的靶點。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點篩選為明確淫羊藿-牛膝藥對潛在靶點與ONFH相關(guān)靶點之間的相互作用，運用Venny 2.1.0平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將淫羊藿-牛膝藥對成分靶點與疾病靶點取交集并繪制韋恩圖。運用Cytoscape 3.8.0中的BisoGenet，將淫羊藿-牛膝藥對潛在靶點和ONFH的靶點分別導(dǎo)入BisoGenet，各生成1 個PPI 網(wǎng)絡(luò)，再使用Cytoscape 中Merge取兩者交集網(wǎng)絡(luò)，最后利用CytoNCA［19］分析交集網(wǎng)絡(luò)并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲進一步篩選出關(guān)鍵靶點。

1.5 淫羊藿-牛膝藥對成分——ONFH 靶點功能與通路的富集分析Metascape 平臺（https：//metascape.org）每月整合多個權(quán)威數(shù)據(jù)庫，更新基因注釋，具備富集分析、構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)的強大功能［20-21］。將淫羊藿-牛膝調(diào)治股骨頭壞死的共同靶點錄入Metascape 平臺，獲取其主要的生物學(xué)過程和信號通路并進行富集分析，將獲得的四個數(shù)據(jù)庫資料根據(jù)P 值選用TOP20 數(shù)據(jù)采用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO富集分析條形圖、KEGG通路富集分析氣泡圖。

1.6 分子對接驗證選擇“活性成分——靶點”網(wǎng)絡(luò)中的核心成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中治療ONFH相關(guān)的關(guān)鍵靶點蛋白運用PUB 數(shù)據(jù)庫、PDB 數(shù)據(jù)庫，結(jié)合Autodock Tools 軟件、Autodock-vina1.1.2 軟件進行分子對接，預(yù)測靶點蛋白與小分子之間發(fā)生的交互作用，進而評價淫羊藿-牛膝藥對活性成分與關(guān)鍵靶點之間的對接效果。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿、牛膝活性成分與靶點的獲取初步提取淫羊藿化學(xué)成分130種、牛膝化學(xué)成分176種，經(jīng)ADME篩選后共獲得淫羊藿有效活性成分23種、牛膝有效活性成分16種，包括槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、廣玉蘭內(nèi)酯（magnograndiolide）、漢黃芩素（wogonin）等。淫羊藿有效成分作用靶點459 個，牛膝有效成分作用靶點403個，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點231 個。利用Cytoscape 3.8.0 對淫羊藿、牛膝藥對活性成分及其作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進行繪制和分析，共獲得270 個節(jié)點與901 條關(guān)系，節(jié)點的面積代表Degree 值大小，面積越大說明該節(jié)點越重要。見表1、圖1。

表1 淫羊藿-牛膝主要活性成分

圖1 淫羊藿-牛膝藥對活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 ONFH 相關(guān)靶點的獲取從GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共獲得ONFH 潛在靶點2033 個，Relevance Score 值越高代表該靶點與疾病聯(lián)系更密切。此次研究設(shè)定Relevance Score 大于中位數(shù)的目標靶點作為ONFH的潛在靶點，在該數(shù)據(jù)庫中ONFH靶點Relevance Score最大值為99.71，最小值為0.18，中位數(shù)為4.74，故設(shè)定Relevance Score＞4.74的靶點為ONFH的潛在靶點共1017個。結(jié)合OMIM、DrugBank 數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，合并3 個數(shù)據(jù)庫相關(guān)靶點后刪除重復(fù)值，最終得到2131個ONFH相關(guān)靶點。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選出來的藥物有效活性成分靶點與ONFH 疾病靶點取交集，并通過Venny 平臺制作韋恩圖，得到淫羊藿-牛膝藥對藥物成分——ONFH 共同靶點138 個，見圖2。運用Cytoscape 3.8.0 分別構(gòu)建淫羊藿-牛膝藥對和ONFH 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，從結(jié)果看：淫羊藿-牛膝藥對潛在靶點可能與7865 個靶點產(chǎn)生作用，交互關(guān)系有175281 種；與ONFH 相關(guān)的靶點共有13263 個，交互關(guān)系可達246136 種，取兩者交集網(wǎng)絡(luò)，如圖3。運用網(wǎng)絡(luò)拓撲后，進行2次篩選出關(guān)鍵靶點80個，篩選策略見圖4。

圖2 淫羊藿-牛膝藥對藥物成分ONFH靶點韋恩圖

圖4 淫羊藿-牛膝藥對關(guān)鍵節(jié)點篩選策略圖

2.4 靶點功能與通路的富集分析應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺對上述獲取的80 個淫羊藿-牛膝藥對調(diào)治ONFH 關(guān)鍵節(jié)點進行信號通路分析，借助微生信平臺對結(jié)果進行可視化。由結(jié)果可見，多個靶點的功能與ONFH 的發(fā)生密切相關(guān)。淫羊藿-牛膝藥對主要參與的生物學(xué)過程包括對無機物的應(yīng)答（response to inorganic substance）、對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對受傷的應(yīng)答（response to wounding）、細胞對有機環(huán)化合物的應(yīng)答（cellular response to organic cyclic compound）、對毒性物質(zhì)的反應(yīng)（response to toxic substance），見圖5中BP；在細胞組分中，主要作用于細胞膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）等，見圖5中CC；相關(guān)靶點調(diào)節(jié)ONFH的功能主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合（transcription factor activity，direct ligand regulated sequencespecific DNA binding）、蛋白激酶結(jié)合（protein kinase binding）、細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）等，見圖5 中MF。將KEGG 通路結(jié)果繪制成氣泡圖，氣泡顏色從青到紅代表Log10（P）值由小到大，氣泡面積代表該通路的基因計數(shù)，橫軸代表該通路基因所占有的比值，如圖6 所示，KEGG 富集通路顯示淫羊藿-牛膝藥對防治ONFH 的 通 路 與PI3K-Akt 信 號 通 路、MAPK 信 號 通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、癌癥通路以及破骨細胞的分化等相關(guān)。

圖5 淫羊藿-牛膝藥對治療ONFH作用靶點富集分析條形圖

圖6 淫羊藿-牛膝藥對治療ONFH KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 分子對接結(jié)果選取活性成分——靶點網(wǎng)絡(luò)圖中前2個有效成分與關(guān)鍵靶點TP53進行分子對接驗證，分子對接結(jié)果顯示關(guān)鍵活性成分quercetin、kaempferol 與治療ONFH 的關(guān)鍵作用靶點TP53 具有較好的結(jié)合活性，說明該研究的預(yù)測較為可靠。見圖7。

圖7 藥物關(guān)鍵成分與核心靶點TP53分子對接結(jié)果

3 討論

通過分析表1和圖1可以得出淫羊藿-牛膝藥對治療ONFH 的核心有效成分可能為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）等。槲皮素是一種類黃酮化合物，存在于諸多植物類中藥材中，淫羊藿和牛膝成分中都含有槲皮素，藥理學(xué)研究表明，槲皮素具有抗炎、預(yù)防氧化等作用［22］，可通過MAPK 信號通路恢復(fù)成骨細胞功能，進而起到骨保護的功能［23-24］。山柰酚是黃酮醇類化合物，也同時包含在淫羊藿、牛膝之中，現(xiàn)代藥理學(xué)證明山柰酚具有防治癌癥、抗炎抗氧化等功效。漢黃芩素是從黃芩中提取出來的化合物，研究證明漢黃芩素具有抗炎抗氧化、保護血管等作用［25-26］。ONFH臨床疼痛癥狀多由于炎癥的局部反應(yīng)所致，而活性物質(zhì)槲皮素、山柰酚、漢黃芩素在炎癥反應(yīng)中均具有獨特的生物特性，與治療ONFH的理念不謀而合。

本研究經(jīng)篩選后共得到80 個關(guān)鍵節(jié)點。根據(jù)Degree 值排名，其中較為重要的靶點有TP53、PPARG、PTGS2 等。有研究表明，產(chǎn)生ONFH 重要因素之一是脂質(zhì)代謝紊亂，PPARG 正是體內(nèi)脂肪形成的必要的轉(zhuǎn)錄因子，密切參與體內(nèi)脂肪的代謝過程［27-28］。TP53 是一種抑癌基因，密切參與細胞凋亡，研究證實TP53 的高表達與ONFH 有關(guān)，其作用機制為上調(diào)凋亡因子Bax的表達［29-30］。

由KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，淫羊藿-牛膝藥對治療ONFH 主要涉及以下幾個信號通路：PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路、癌癥通路。1）PI3K-AKT 信號通路：李云隆等［31］認為PI3K通過激活激酶系統(tǒng)促使AKT逐漸被磷酸化，磷酸化后的AKT激活下游靶蛋白mTOR，從而激活該通路可以抑制自噬，進而改善ONFH 的進程。同時該通路已被證實與血管修復(fù)再生、成骨細胞分化、破骨細胞分化密切相關(guān)［32］。2）MAPK 信號通路：骨代謝失衡是導(dǎo)致ONFH 發(fā)生的重要機制，MAPK 是調(diào)節(jié)骨代謝平衡的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，密切參與成骨細胞的增殖分化［33］，同時也是槲皮素干預(yù)ONFH 的重要因素［34］。由此可見淫羊藿-牛膝藥對可通過MAPK 信號通路調(diào)節(jié)骨代謝從而發(fā)揮治療作用。3）HIF-1 信號通路：研究證明，缺血缺氧同樣也是導(dǎo)致ONFH 發(fā)生的重要機制［35］，HIF-1 信號通路是一種經(jīng)典的缺氧代謝通路［36］，該信號通路在缺氧時密切參與了血管生成、骨吸收和新骨生成的骨修復(fù)過程［37］。

綜上所述，淫羊藿-牛膝藥對調(diào)治ONFH 的主要成分可能是槲皮素、山柰酚、漢黃芩素等，涉及到的通路有PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、癌癥通路等，與自噬、缺氧應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管生成、骨代謝等多個生物學(xué)過程息息相關(guān)，由此可知，淫羊藿-牛膝相須配伍使用并不是簡單的相同成分含量的增加，而是通過信號通路互補，這為治療ONFH 的臨床用藥提供一定的理論參考，同時為新藥的研發(fā)提供新思路。