響應面法優化冰糖草總黃酮提取工藝及抗氧化活性分析*

陳麗珍，侯 杰，趙 珂，魏 娜，高麗玉，勞佳麗

海南醫學院藥學院，海南 海口 571199

冰糖草為玄參科野甘草屬植物野甘草Scoparia dulcis L．的全草，又名野甘草、假枸杞、香儀、米碎草等。它是多年生草本植物，生長于熱帶和亞熱帶地區，我國主要分布在廣西、廣東、海南、福建、臺灣等地。冰糖草性涼味甘，可全株入藥，具有清熱解毒，健胃疏風，鎮咳止癢，利尿消腫的功效，常用于治療肺熱咳嗽、腳氣浮腫、腸炎、高血壓和濕疹熱痱等病證［1-3］。在國外還用于治療牙痛、淋病、糖尿病、胃病和肝機能障礙等［4-5］。已有文獻［4，6］報道了冰糖草的化學成分、藥理活性［4，7-8］、生藥學［9］等方面的研究，發現其主要含有二萜類、黃酮類、生物堿等化學成分，具有降血糖血壓、抗胃潰瘍、抗菌、抗病毒、抗癌和治療肝機能障礙等多種藥理活性［3］，是一種很具開發應用前景的中草藥。抗氧化劑可有效清除人體新陳代謝過程中產生的過量自由基，還可預防心臟疾病、癌癥、老年癡呆癥等多種疾病。自然界中，很多來源于植物的黃酮、酚類、多糖、皂苷類等都具有很好的抗氧化活性［10］。因此，從天然植物中提取開發新型安全有效的抗氧化劑已被廣泛關注。然而，關于響應面法優化冰糖草總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性方面的研究未見報道。為了更好地開發和利用豐富的冰糖草資源，本研究在單因素試驗基礎上，應用響應面法優化冰糖草總黃酮的提取工藝，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力和測定鐵氰化鉀還原能力的方法評價其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 試藥及儀器 冰糖草，采自海南省萬寧市龍滾鎮周邊地區，經海南醫學院藥學院曾念開教授鑒定為玄參科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，烘干，分離粉粹并過80 目篩，密封低溫干燥避光保存備用；蘆丁對照品（上海源葉，批號：B20771）；維生素C（Vc）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（上海阿拉丁，批號：Y01M7S10307）；其他試劑均為國產分析純。SK3210HP 超聲波清洗器（上海科導公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（鞏義予華公司）；RE-2000B 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6053 型真空干燥箱（上海一恒公司）；AE100 型電子分析天平（上海梅特勒-托利多公司）；UV-1600型紫外可見分光光度計（北京瑞利公司）；800C型臺式離心機（上海安亭公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 繪制標準曲線［11-12］采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法。取7 個25 mL 容量瓶，分別精密量入0.246 mg/mL 的蘆丁對照品溶液0、1、2、4、6、8 mL，分別加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min；各加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻靜置6 min；再加入4%NaOH 溶液4 mL，用蒸餾水定容，搖勻，放置15 min后在510 nm 處測定吸光值。以蘆丁標準溶液的質量濃度C（ug/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，制得標準曲線及回歸方程：A=10.677C-0.002 8，r=0.999 7，表明在9.8～78.7 ug/mL 測定濃度的線性關系良好。

1.2.2 冰糖草總黃酮的提取和含量測定 精密稱取冰糖草粉末4.0 g于磨口三角瓶中，在設定的試驗條件下按一定的乙醇體積分數、液料比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率進行超聲提取，固定提取次數為2次，抽濾，合并2次濾液，定容于容量瓶中，搖勻即得待測樣品溶液。準確吸取一定量樣品溶液置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.1”項中的方法處理后測定吸光度，代入標準曲線回歸方程計算總黃酮含量（W），結果以每克冰糖草干藥草中含有相當蘆丁的毫克數來表示（mg/g），計算公式為W=c×V×N/m，式中：c 為樣品的吸光度代入回歸方程計算得到的總黃酮濃度，mg/mL；N 為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；m為樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗 在下列設定好的提取條件下進行冰糖草總黃酮的提取，考察各因素對總黃酮提取量的影響。設定液料比25∶1 mL/g，提取溫度為50℃，不同體積分數（40%、50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇溶液為溶劑，超聲功率為250 W，超聲處理40 min；溶劑為70%乙醇溶液，液料比25∶1 mL/g，超聲功率為250 W，置于不同溫度（35、40、45、50、55、60℃）的水浴中超聲處理40 min；提取溫度50℃，溶劑為70%乙醇溶液，液料比25∶1 mL/g，超聲功率為250 W，分別超聲處理（20、40、60、80、100、120 min）；提取溫度50℃，溶劑為70%乙醇溶液，液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g），超聲功率為250 W，超聲處理40 min。

1.2.4 響應面優化試驗 在單因素試驗基礎上，根據Box-Benhnken 中心組合試驗原理，選取乙醇體積分數（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）為考察因素，以冰糖草總黃酮提取量為響應值，采用Design-Expert10.0 軟件進行三因素三水平響應面法的設計與分析，由此優化得冰糖草總黃酮的最佳提取工藝條件。試驗因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平

1.2.5 抗氧化活性測定 將最佳工藝提取得到的總黃酮提取液，經減壓濃縮后，真空干燥得到粗總黃酮粉。經減壓濃縮至約原體積的1/4，加入4倍體積95%乙醇溶液，在4℃條件下過夜靜置，抽濾，自然干燥，即得粗總黃酮粉。

1.2.5.1 清除DPPH 自由基能力的測定 用70%乙醇溶解配成1 mg/mL粗總黃酮樣品溶液，并作梯度稀釋。參照楊文平等［13］的方法并適當改進。DPPH 乙醇溶液濃度為50 ug/mL。分別在2 mL DPPH 溶液中加入1.0 mL 梯度質量濃度的樣品溶液，混勻，暗處室溫放置30 min 后，于517 nm 處測定吸光度，即為A1；在3 mL DPPH 溶液中加入1 mL的樣品溶劑作空白對照，同樣條件下測定吸光度，即為A0；同時以Vc作為陽性對照。

1.2.5.2 還原能力的測定 用70%乙醇溶解配成1 mg/mL粗總黃酮樣品溶液，并作梯度稀釋。參照BERKER［14］方法略作修改，分別吸取梯度質量濃度1 mL置于10 mL離心管，再加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液2 mL 和1%鐵氰化鉀1 mL。混勻置于50℃水浴保溫20 min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸2 mL，混勻，4000 r/min 離心10 min。取上清液4 mL，加入蒸餾水1 mL 和0.1%的三氯化鐵水溶液0.5 mL，混勻靜置10 min，以蒸餾水作空白參比，在700 nm處測定吸光度值，并與相同濃度Vc的還原力進行比較。吸光值越大表示還原能力越強。

1.3 統計學方法采用Excel 2010、GraphPad Prism 8.0.2 和Design-Expert10.0 軟 件 進 行 數據處理與分析。

2 結果

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響 總黃酮提取量隨著乙醇體積分數的增加而上升，當乙醇體積分數達到70%時，提取量最大，之后開始呈下降趨勢。這是可能因為隨著乙醇體積分數的增加，溶劑對物料的滲透性和對細胞膜的破壞性隨之增大［15］，提高了黃酮類成分的溶出率；而繼續增加體積分數使得其他醇溶性成分溶出量增多［16］，反而降低了提取量。故乙醇體積分數以70%為宜。見圖1。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響

2.1.2 液料比對總黃酮提取量的影響 總黃酮提取量隨著提取劑用量的增加而呈上升趨勢，當液料比達到30∶1 mL/g 時，提取量最大，之后繼續增加溶劑用量，提取量反而呈下降趨勢。這可能是因為在一定范圍內，溶劑用量增加，溶質的分散程度好，接觸面積大［17］，有利于黃酮類成分的溶出。當溶劑用量進一步增加時，黃酮類成分溶出趨于飽和，反而促使其他雜質的溶出，使得提取量下降。故液料比以30∶1 mL/g為宜。見圖2。

圖2 液料比對總黃酮提取量的影響

2.1.3 超聲溫度對總黃酮提取量的影響 隨著提取溫度升高，總黃酮提取量呈上升趨勢，當提取溫度達到55℃時，提取量最大，之后升高溫度反而使得提取量下降。這可能是因為隨著溫度升高，加速了黃酮類成分的滲透，增加溶解速度和擴散作用［17］，促使溶出。但溫度過高，會導致部分受熱不穩定的黃酮物質氧化和降解［18］，降低提取量。故超聲提取溫度不宜超過55℃。見圖3。

圖3 超聲溫度對總黃酮提取量影響

2.1.4 超聲時間對總黃酮提取量的影響 隨著超聲提取時間的延長，總黃酮提取量變化不大，但當超聲提取時間為80 min時，提取量最大，隨后提取量呈緩慢下降趨勢。這可能是由于當超聲時間達到80 min，黃酮類成分已基本完全溶出，繼續延長時間，有可能使黃酮類成分發生降解或也伴隨著其他雜質的溶出［15］，導致提取量下降。故超聲提取時間以80 min為宜。見圖4。

圖4 超聲時間對總黃酮提取量影響

2.1.5 超聲功率對總黃酮提取量的影響 當超聲功率在125～225 W 范圍內，隨著超聲功率的增大，總黃酮提取量增加很緩慢，變化不大，而當功率從225 W增加至250 W時，提取量上升較快，且在250 W 時達到最大值。這可能是因為隨著超聲功率增大，超聲波增加了物料細胞的破碎程度與滲透性［17］，促使黃酮類成分的溶出。故超聲功率以250 W為宜。見圖5。

圖5 超聲功率對總黃酮提取量的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 試驗設計及結果 響應面試驗方案及結果見表2。

2.2.2 回歸方程方差分析 對表2數據進行回歸分析，建立提取工藝參數回歸模型，得回歸方程為：Y=36.45+1.31A+1.37B+0.54C+0.56AB-1.85AC-1.32BC-2.48A2-4.15B2-2.88C2。

方差分析結果如表3所示。回歸模型的F值為71.41，P＜0.000 1（極顯著），失擬項P=0.092 8＞0.05（不顯著），決定系數R2=0.989 2，校正系數RAdj2=0.975 4，表明模型擬合試驗結果良好，試驗值與預測值相關性高，有近98%的真實值可由該模型預測，有97%的試驗結果受試驗因素的影響。因此所建模型可靠，可用于分析和預測總黃酮提取的結果。通過比較F值的大小，判斷各因素對總黃酮提取量影響的主次順序為乙醇體積分數＞液料比＞超聲溫度；由P值及顯著性結果可知，對總黃酮提取量的影響達到極顯著的因素有一次項A、B、C及二次項A2、B2、C2，交互項AC、BC對總黃酮提取量的影響達到顯著。見表2—3。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸方程方差分析

2.2.3 響應曲面分析 由所得的回歸模型作出相應的響應曲面圖，可進一步直觀反映各試驗因素對響應值影響的兩兩交互作用及相對顯著性。響應面坡度越陡，表明因素對響應值的影響越大；反之則其影響越小［15］。在交互項對提取量的影響中，液料比與超聲溫度和超聲時間與超聲功率之間交互作用顯著，其他因素之間交互作用不顯著，這與方差分析的結果一致。見圖6。

圖6 各因素交互作用對總黃酮提取量的響應曲面

2.3 最佳提取工藝及驗證應用Design Expert 10.0 軟件進行工藝參數的優化分析，得到預測的冰糖草總黃酮提取的最佳工藝參數為乙醇體積分數71.93%，液料比31.52∶1 mL/g，超聲溫度54.76℃，提取量可達到36.77 mg/g。為驗證模型有效性，考慮到實際操作將冰糖草總黃酮的最佳提取工藝參數調整為乙醇體積分數72%、料液比32∶1 mL/g、提取溫度55℃。在此條件下平行提取5 次，所得到提取量為36.82 mg/g，與預測值接近，表明該模型可靠，優化所得工藝可行。

2.4 體外抗氧化活性結果在測定的質量濃度范圍內，冰糖草總黃酮具有抗氧化活性，且隨著質量濃度的增加而呈現增強趨勢，呈現明顯的量效關系。由圖7（a）可知，在2.12～10.60μg/mL的相同濃度內，冰糖草總黃酮和Vc對DPPH自由基的清除率均隨著濃度的升高而增強，分別為總黃酮26.69%～80.15%和Vc 21.58%～70.24%；由GraphPad Prism 8.0.2 處理得IC50為總黃酮4.23 ug/mL、Vc 5.54 ug/mL。整體上總黃酮的清除能力高于Vc，表明冰糖草總黃酮具有較強的清除能力。由圖7（b）可知，在1.43～7.15 ug/mL 的相同濃度內，冰糖草總黃酮與Vc 的吸光值都隨質量濃度的增加而增大，分別為總黃酮0.363～0.885和Vc 0.218～0.821，還原能力也明顯增強，而整體上總黃酮的還原能力略低于Vc，但仍說明冰糖草總黃酮具有一定的還原能力。見圖7。

圖7 冰糖草總黃酮抗氧化活性

3 小結

以冰糖草為原料，乙醇溶液為溶劑，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法對超聲輔助提取冰糖草總黃酮的工藝進行優化，確定最佳工藝條件為：采用響應面法考察冰糖草總黃酮提取量的影響因素，優化得到冰糖草總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇體積分數72%、料液比32∶1 mL/g、提取溫度55℃。得到冰糖總黃酮含量為36.82 mg/g，與模型預測值36.77 mg/g 較接近，表明建立的模型可靠，該提取工藝穩定合理，是提取冰糖草總黃酮的可行方法。抗氧化活性測定結果顯示，冰糖草總黃酮對DPPH 自由基有較好的清除能力及還原能力，表明冰糖草總黃酮具有較好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑資源。該研究為冰糖草的進一步開發及天然抗氧化劑的應用提供了理論依據。同時冰糖草總黃酮的體內抗氧化活性及其具體化學成分的分離純化有待下一步研究。