慢病毒敲減質(zhì)粒pLKO.1-shDAPK1的構(gòu)建及其對細(xì)胞凋亡的影響

秦坤 徐紹業(yè) 韓雨 閆建國 夏春波 邵曉云

桂林醫(yī)學(xué)院1人體解剖學(xué)教研室，2科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，3生理學(xué)教研室（廣西 桂林 541100）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的進(jìn)行性、變性性疾病，黑質(zhì)多巴胺能（dopaminergic，DAG）神經(jīng)元選擇性凋亡被認(rèn)為是PD 的主要病理變化之一［1］。已有研究發(fā)現(xiàn)，DAG神經(jīng)元軸突終末變性可能是導(dǎo)致PD 發(fā)生細(xì)胞凋亡的首要因素，而軸突嚴(yán)重變性時(shí)可能導(dǎo)致了細(xì)胞骨架蛋白——微管的功能異常［2-3］。

死亡相關(guān)蛋白激酶1（death-associated protein kinase，DAPK1）是一種編碼160 KDa蛋白的鈣離子/鈣調(diào)蛋白（Ca2+/CaM）依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶，廣泛表達(dá)于人、大鼠和小鼠的正常組織中，以腦組織和肺組織表達(dá)最強(qiáng)，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如阿爾茨海默病、中風(fēng)等）的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用［4］。DAPK1 作為腫瘤抑制因子，可正性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)減少，但其在神經(jīng)退行性病變中則表達(dá)增多［5］。而且，DAPK1 還可以調(diào)節(jié)微管的合成、神經(jīng)元分化以及微管相關(guān)蛋白Tau 的毒性［6］。目前，DAPK1 在PD 中的研究甚少。因此，本研究通過構(gòu)建pLKO.1-shDAPK1 慢病毒敲減質(zhì)粒，包裝病毒后感染并篩選穩(wěn)定低表達(dá)DAPK1的SH-SY5Y 細(xì)胞系，驗(yàn)證DAPK1 在SH-SY5Y 細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，并證明在SH-SY5Y 細(xì)胞中抑制DAPK1 對細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究DAPK1 在PD 中的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)（載體質(zhì)粒pLKO.1-TRC、輔助質(zhì)粒psPAX2 和pMD2.G）及SH-SY5Y 細(xì)胞由西安空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院楊倩教授惠贈(zèng)；HEK293T 細(xì)胞由我校科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)；shRNA-DAPK1 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和AgeⅠ、T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA分子量Marker 購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國賽默飛世爾公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國GIBCO 公司；FBS 標(biāo)準(zhǔn)級(jí)胎牛血清購自上海依科賽公司；嘌呤霉素購自翊圣生物科技（上海）有限公司；兔抗人DAPK1 多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Proteintech 公司；鼠抗人Caspase-3 單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2 單克隆抗體和鼠抗人Bax 單克隆抗體購自Santa Cruz 公司；二抗購自北京中杉；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FACSCanto流式細(xì)胞分析儀購自美國Beckman Coulte 公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA 干擾片段設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Sigma公司網(wǎng)站Mission shRNA 模塊（https：//www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/semi-configurators/shrna?activeLink），獲得shRNA-DAPK1 靶標(biāo)序列，參考shRNA 設(shè)計(jì)策略，以CTCGAG 為loop 環(huán)，并在引物兩端分別加入EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點(diǎn)，最終設(shè)計(jì)shDAPK1 上游引物為5'-CCGGCCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAAGGTATCGACGTGGTTTTTG-3'，下游引物為5'-AATTCAAAAACCACGTCGATACCTTGAAATTCTCGAGAATTTCAAGGTATCGACGTGG-3'，由生工生物公司合成。將合成的引物稀釋為20 μmol/L，95 ℃水浴10 min，自然冷卻至室溫，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫嘶鸷蟮囊锛礊榫哂姓承阅┒说碾p鏈shDNA 干擾片段。

1.2.2 質(zhì)粒重組用核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和AgeⅠ對pLKO.1慢病毒載體進(jìn)行雙酶切，將適量的酶切產(chǎn)物與退火引物在T4 連接酶的作用下4 ℃過夜。次日，將連接產(chǎn)物用DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化、種板，挑取單克隆搖菌并提質(zhì)粒后送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，最終確定重組慢病毒敲減質(zhì)粒pLKO.1-shDAPK1構(gòu)建正確與否。

1.2.3 病毒包裝取對數(shù)生長期HEK293T 細(xì)胞重懸接種，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，用Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑將重組慢病毒pLKO.1-shDAPK1 敲減質(zhì)粒（包括輔助質(zhì)粒pMD2.G 和psPAX2）轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞中，以空載體pLKO.1-TRC 作為陰性對照（shNC）。轉(zhuǎn)染16 h 后換液，并于72 h 收集上清培養(yǎng)基，用0.45 μm 濾器過濾后獲得慢病毒溶液，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病毒感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系篩選將SH-SY5Y細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，待其匯合度約為40%～50%時(shí)，以半量換液方式換為pLKO.1-shDAPK1 或pLKO.1-shNC 慢病毒感染液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后更換為正常培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至平臺(tái)期時(shí)進(jìn)行傳代，并應(yīng)用加入5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，設(shè)置未感染病毒的細(xì)胞為空白對照組（Control），經(jīng)過4～6 次嘌呤霉素篩選傳代后，當(dāng)未感染病毒的對照組細(xì)胞全部死亡，而感染了病毒的pLKO.1-shDAPK1 或pLKO.1-shNC 組的細(xì)胞大量存活，獲得敲減DAPK1 的穩(wěn)定感染細(xì)胞系shDAPK1-SY5Y 和陰性對照shNC-SY5Y，并對其進(jìn)行擴(kuò)增保種和后續(xù)鑒定。

1.2.5 Western blot 檢測DAPK1 敲減效率收集穩(wěn)定感染慢病毒pLKO.1-shDAPK1 或pLKO.1-shNC的SH-SY5Y 細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，以40 μg 蛋白上樣量用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白免疫印跡，應(yīng)用兔抗人DAPK1 抗體（1∶1 000）Western blot 檢測shDAPK1-SY5Y 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中DAPK1 的蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 檢測敲減DAPK1 對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響將pLKO.1-shDAPK1 慢病毒感染的SH-SY5Y 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系培養(yǎng)至70%左右匯合時(shí)加入MPP+（200 μmol/L）作用24 h，同時(shí)設(shè)置空白對照組（Control），各組分別設(shè)置兩份，第一份收集細(xì)胞總蛋白，以40 μg 蛋白上樣量用12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白免疫印跡，應(yīng)用鼠抗人Caspase-3單克隆抗體（1∶1 000）、鼠抗人Bcl-2 單克隆抗體（1∶1 000）和鼠抗人Bax 單克隆抗體（1∶1 000）Western blot 檢測經(jīng)MPP+作用后細(xì)胞系中Caspase-3、Bcl-2 和Bax 的蛋白表達(dá)情況；第二份收集細(xì)胞，用1×PBS 重懸并計(jì)數(shù)，取5×105重懸的細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，最后加入10 μL 碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻。室溫（20～25 ℃）避光孵育10～20 min，篩網(wǎng)過濾并移入流式上樣管，立即上機(jī)檢測，使用FlowJo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以（±s）表示，實(shí)驗(yàn)組和對照組蛋白表達(dá)水平采用非配對t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異性檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒質(zhì)粒pLKO.1-shDAPK1的構(gòu)建及鑒定將慢病毒骨架質(zhì)粒pLKO.1-TRC（全長8 901 bp），用EcoRⅠ和AgeⅠ雙酶切后得到7 026 bp 和1 875 bp兩個(gè)片段（圖1），回收酶切后的線性載體（7 026 bp）并將其與退火的目的干擾片段用T4 連接酶進(jìn)行連接，單克隆后進(jìn)行DNA 測序，測序結(jié)果顯示，重組慢病毒質(zhì)粒pLKO.1-shDAPK1 的DNA 序列與所設(shè)計(jì)的干擾序列完全一致（圖2），表明慢病毒敲減質(zhì)粒pLKO.1-shDAPK1 構(gòu)建成功。

圖1 pLKO.1-TRC 空載質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Enzyme digestion results of pLKO.1-TRC-vector

圖2 重組PLKO.1-shDAPK1 質(zhì)粒DNA 測序及序列比對Fig.2 DNA sequencing and sequence alignment of recombinant PLKO.1-shDAPK1 plasmid

2.2 慢病毒包裝及穩(wěn)定干擾DAPK1基因的SH-SY5Y細(xì)胞系的建立將pLKO.1-shDAPK1（或pLKO.1-shNC）表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h 后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示pLKO.1-shDAPK1（或pLKO.1-shNC）質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染并在HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)（圖3）；同時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒液感染SH-SY5Y 細(xì)胞，提取具有嘌呤霉素抗性的細(xì)胞總蛋白，Western blot 檢測結(jié)果顯示，在感染pLKO.1-shDAPK1 病毒的SH-SY5Y 細(xì)胞中DAPK1 蛋白的表達(dá)量明顯低于對照組（pLKO.1-shDAPK1&pLKO.1-shNC，P＜0.000 1；pLKO.1-shDAPK1 & control，P＜0.000 1）（圖4），表明感染pLKO.1-shDAPK1 慢病毒顆粒的SH-SY5Y 細(xì)胞穩(wěn)定敲減了DAPK1 基因。

圖3 DAPK1 在病毒包裝的HEK293T 細(xì)胞中的蛋白表達(dá)Fig.3 DAPK1 protein expression in HEK293T cells packaged shDAPK1 plasmid by lentivirus

圖4 慢病毒感染的SH-SY5Y 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中DAPK1 蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of DAPK1 protein in SH-SY5Y stably transfected cell line infected

2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白在敲減DAPK1的SH-SY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)水平收集經(jīng)MPP+處理的細(xì)胞并提取總蛋白，Western blot 檢測結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組與空白對照組比較，經(jīng)MPP+處理后Bax表達(dá)下降，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax/Bcl-2比值降低，Caspase-3活性下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，圖5）。提示敲減DAPK1 會(huì)抑制帕金森病細(xì)胞模型中Bax/Bcl-2 比值升高，Caspase-3 活性上調(diào)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖5 慢病毒感染的SH-SY5Y 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of apoptosis related proteins in SH-SY5Y stable cell line infected with lentivirus

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制DAPK1 對細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組（control-MPP+）SH-SY5Y 細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，而DAPK1 敲減組（shDAPK1-MPP+）的細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1，圖6）。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡Fig.6 Apoptosis of SH-SY5Y cells was detected by flow cytometry

3 討論

PD 的主要特征是黑質(zhì)DAG 神經(jīng)元的進(jìn)行性不可逆丟失，異常聚集的α-synuclein 蛋白是PD 的病理學(xué)標(biāo)志物，其過表達(dá)可促進(jìn)多種細(xì)胞系和動(dòng)物模型中凋亡細(xì)胞的死亡。研究表明，α-synuclein參與了多種生物過程，包括神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制和腦功能異常等［7］；DAG 神經(jīng)元凋亡是神經(jīng)遞質(zhì)變化、氧化應(yīng)激、線粒體功能損傷、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等多種因素共同作用的結(jié)果［8］。但當(dāng)前對帕金森病的治療僅限于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，并不能減緩黑質(zhì)DAG 神經(jīng)細(xì)胞凋亡或退行性變，其主要原因可能是人們對造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡或退行性變的分子機(jī)制了解甚少。

蛋白激酶是催化末端磷酸基團(tuán)從ATP 轉(zhuǎn)移到其他蛋白質(zhì)的酶［9］。通過磷酸化某個(gè)蛋白質(zhì)殘基（Tyr，酪氨酸激酶；Ser/Thr，Ser/Thr 激酶），激酶共價(jià)調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)的活性，最終控制人類細(xì)胞的幾乎所有方面，包括細(xì)胞增殖、發(fā)育和存活［10］。對人類基因組的分析揭示了迄今為止已知的518種激酶，以及幾種激酶突變體、脂質(zhì)激酶和假激酶［11-12］。蛋白激酶家族可分為兩大亞組：蛋白酪氨酸激酶（PTKs）和STKs［13-14］。STKs 細(xì)分為六個(gè)主要亞組，包括cAMP 依賴性蛋白激酶/蛋白激酶G/蛋白激酶C 擴(kuò)展家族（AGC）；鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（CaMK）；CDK、MAPK、糖原合酶激酶和CDK 樣結(jié)構(gòu)域（CMGC）；STE11 和STE20（STE）的同源物；酪蛋白激酶（CK）；和酪氨酸激酶樣（TKL）組［15-17］。

死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）家族是STKs 家族中的重要家族之一，在人類細(xì)胞中調(diào)控多種生物學(xué)功能。DAPK 家族結(jié)構(gòu)域包括DAPK1、DAPK2（又名DAPK 相關(guān)蛋白激酶1；DRP-1）和DAPK3（又名拉鏈相互作用蛋白激酶，也稱為DAP 樣激酶，Dlk），以及DRAK1和DRAK2（DAPK 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)蛋白激酶1 和2，也分別稱為STK-17A 和B；STK17A 和B）［18-19］。DAPK1 是一種在神經(jīng)元發(fā)育過程中高表達(dá)的促凋亡激酶，負(fù)責(zé)多種類型（包括凋亡和自噬）的細(xì)胞死亡，與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如中風(fēng)、抑郁癥和阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）等。DAPK1 是凋亡細(xì)胞死亡的正調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞死亡中具有關(guān)鍵功能，可以調(diào)節(jié)多種神經(jīng)元損傷模型中的細(xì)胞凋亡［4，20-22］。研究［23］表明，在成年大腦中，神經(jīng)元死亡時(shí)，DAPK1 重新激活并被招募到突觸外NMDAR 復(fù)合物中，放大毒性受體功能。在PD 模型小鼠和PD 患者的研究中顯示，由于轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα 降低而導(dǎo)致miR-26a 缺失，從而導(dǎo)致DAPK1 轉(zhuǎn)錄后表達(dá)升高，miR-26a 的缺失和DAPK1 的過表達(dá)都誘導(dǎo)了α-synuclein 的過度磷酸化、聚集和包含的形成，從而進(jìn)一步導(dǎo)致DAG神經(jīng)元的死亡和運(yùn)動(dòng)異常［24］。抑制DAPK1 已在中風(fēng)、AD、PD 和慢性應(yīng)激的動(dòng)物模型中顯示出有益之處，其原因主要是抑制DAPK1 活性或表達(dá)可減輕中風(fēng)小鼠模型中神經(jīng)元細(xì)胞的死亡以及AD動(dòng)物模型中與AD 相關(guān)的神經(jīng)病理學(xué)，表明抑制DAPK1 可能保護(hù)神經(jīng)元免受損傷［20-21，25］，提示DAPK1 可能是神經(jīng)保護(hù)的新靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步探討PD模型中抑制DAPK1對細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用慢病毒干擾技術(shù)在SH-SY5Y 細(xì)胞中敲減DAPK1。慢病毒載體是一種以人類免疫缺陷型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其在分子以及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)中有著廣泛的應(yīng)用，與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，可選擇的宿主具有多樣性，對分裂細(xì)胞和未分裂細(xì)胞均具有感染能力，能夠有效地將目的基因整合到宿主細(xì)胞中。同樣與傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法相比，慢病毒的轉(zhuǎn)染率更高，并能在載體中持續(xù)而穩(wěn)定的表達(dá)，在構(gòu)建目的基因方面得到廣泛應(yīng)用［26］。本研究選擇pLKO.1-TRC、psPAX2、pMD2.G 三質(zhì)粒系統(tǒng)成功構(gòu)建并包裝了pLKO.1-shDAPK1 慢病毒，Western blot 驗(yàn)證了其感染SH-SY5Y 細(xì)胞后敲減DAPK1 的蛋白表達(dá)水平，經(jīng)嘌呤霉素篩選后獲得了穩(wěn)定低表達(dá)DAPK1 的SH-SY5Y 細(xì)胞系；在應(yīng)用MPP+誘導(dǎo)shDAPK1-SHSY5Y 細(xì)胞構(gòu)建的PD 細(xì)胞模型中，Western blot 與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果均表明抑制DAPK1 可顯著降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生率，這對后續(xù)進(jìn)一步研究DAPK1在PD 發(fā)病過程中的作用奠定了重要的基礎(chǔ)。