廣東省臍帶血造血干細胞庫應用數據分析

史聰穎 周海洋 魏偉 黃婉君 王頎 張復華

1廣東省臍帶血造血干細胞庫（廣州 510663）；2廣州市天河諾亞生物工程有限公司（廣州 510663）；3廣東省婦幼保健院（廣州 523146）；4華南理工大學附屬第六醫院佛山市南海區人民醫院血液腫瘤科（廣東 佛山 528200）

臍血富含多種干細胞與營養物質，包括造血干細胞、間充質干細胞、內皮祖細胞、非限制性體細胞和非常小胚胎/外胚層樣干細胞等［1-2］。由于臍血來源廣泛，并具有特有的免疫學特性，因此，其作為新的造血干細胞移植的供源具有極大的優勢和潛力。目前臍血造血干細胞移植已逐漸成為血液學專家的共識，臍血也越來越多地應用于兒童和成人血液病的治療。除臍血造血干細胞移植外，目前臨床還存在另一種臍血的輸注應用治療方案，即把臍血作為輔助，在外周血造血干細胞移植完成后再輸注到患者體內。該方法將臍血視為一種營養物質，通過臍血中的細胞因子或臍血中單個核細胞的旁分泌作用改善外周血造血干細胞移植的預后癥狀［3-4］。

廣東省臍帶血造血干細胞庫（以下簡稱廣東省臍血庫）是經我國衛生健康委員會批準成立的，隸屬于廣東省婦幼保健院。本研究對廣東省臍血庫2007-2020年臍血臨床應用數據進行了分析報告。

1 資料與方法

1.1 一般資料臍血來自廣東省內二甲以上醫院，采集前產婦均已簽署臍血采集知情同意書，填寫產前化驗檢查結果、健康調查表，以記錄產婦本人及家屬的家族病史和遺傳病史。所有產婦產前經查乙肝表面抗原、丙肝抗體、梅毒抗體、艾滋病抗體均為陰性，地中海貧血及6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏癥均為正常。臍血采集于采血袋中，通過相同的運輸條件送回廣東省臍血庫［5］。剔除缺項數據資料后，最終篩選整理2007～2020年廣東省臍血庫出庫的2 132 例臍血應用資料，這些臍血在應用醫院被用于各類疾病治療，其中公共庫應用1 815 例，自體庫應用317 例。

1.2 試劑與儀器臍血采血袋（山東威高集團，含28 mL 血液保存液），6%羥乙基淀粉（HESPAN?，B.BRAUN 公司），甲基纖維素培養基（StemCell 公司），RPMI-1640 培養基（GIBCO），單抗CD45-FITC、單抗CD34-PE、IgG1-PE、7-AAD 和1%溶血素均購自BD 公司，計數相關試劑均購自Sysmex 公司。醫用低溫離心機（RC 3BP+，Thermo Scientific公司），自動血液分析儀（XE-5000，Sysmex 公司），熱合機（SE250 型，韓國森通），超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇凈安泰空氣技術有限公司），CO2培養箱（FORMA 公司），倒置顯微鏡（CK40 和CKX41，OLYMPUS 公司），流式細胞儀（FACSCalibur，BD 公司）。

1.3 檢測指標

1.3.1 凍前總有核細胞計數（total nucleated cell，TNC）計數濃縮后臍血有核細胞的濃度，根據濃縮血量與有核細胞的濃度乘積計算凍前有核細胞總數。

1.3.2 CD34+細胞含量及有核細胞活性干細胞培養室取樣后的剩余血樣作為待檢樣本。使用單抗CD45-FITC、IgG1-PE（CD34-PE 陰性對照）、單抗CD34-PE 及7-AAD 對樣本進行標記［6］。流式細胞儀檢測已標記好的樣本，根據ISHAGE 標準［7］，利用CD45、CD34 單克隆抗體（CD45 是有核細胞的特異性標志物，CD34 是造血干祖細胞的特異性標志物）來對臍血進行檢測。根據造血干祖細胞的4個特征（CD34 陽性，CD45 弱陽性，低SSC，FSC 與淋巴細胞相似）圈選出造血干祖細胞占有核細胞的含量，即得到CD34+細胞含量。根據7-AAD 可使死細胞染色的原理來檢測臍血中活細胞占有核細胞的含量，即有核細胞活性。

1.3.3 患者輸注細胞數計算每公斤體質量輸注的細胞數量，根據TNC 和患者體質量（kg）的除商計算患者輸注細胞數，單位為107/kg。

1.3.4 粒細胞巨噬細胞集落形成單位（colony forming unit-granulocyte and macrophage，CFUGM）計數根據標本細胞懸液濃度及最終培養體系為3.3 mL，結合計算所需加入的甲基纖維素培養基及細胞懸液的各自體積，制成有核細胞終濃度定量為5×104/mL 的培養體系。將培養體系平均加入6孔培養板的3個孔中，保證每孔都有1 mL。將培養板放入37 ℃、5% CO2、濕度＞95%的CO2培養箱中培養14 d。培養結束取出培養板在倒置顯微鏡下觀察，統計每份臍血培養的3 個孔的集落數，取其均值作為該份臍血的CFU-GM 細胞計數結果。

1.4 方法研究采用回顧性分析方法對這2 132例臍血應用的疾病類型、臍血相關質量指標（TNC、CD34+細胞含量、患者輸注細胞數、臍血凍存年限、患者與匹配的臍血HLA 相合位點數、CFU-GM［5］）以及應用后的效果：如植入情況（成功/失敗）、第100 天總生存率、半年總生存率、1年總生存率、2年總生存率等信息進行統計分析。臍血經程控降溫后，長期保存在-150 ℃以下的氣相液氮管MVE 不銹鋼液氮罐中（CHART，USA）。TNC 利用自動血液分析儀sysmex XE-5000 中提取的白細胞（WBC）計算的。HLA 配對情況為采用PCR 法檢測的低分辨分型配對的數據。所有出庫應用的臍血均進行乙肝表面抗原（HBsAg）、丙肝抗體（HCV-Ab）、梅毒抗體（TP-Ab）、艾滋病抗體（HIV-Ab）和細菌霉菌檢測且結果為陰性，地中海貧血及6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏癥檢測均為正常。對臍血的臨床應用分為兩大類：臨床應用類和科研類。根據《臍帶血造血干細胞治療技術管理規范（試行）》對臍血臨床應用大類治療的疾病分為四類：惡性血液疾病、非惡性血液疾病、免疫缺陷疾病、代謝性疾病。

1.5 統計學方法根據所收集的臍血應用信息，建立統計學量化表格，應用SPSS 18.0 統計軟件進行數據分析，應用Graphpad Prism 8 軟件繪制總生存曲線圖。對分類變量地區、性別、治療類型、HLA配對情況和總生存情況進行賦值，分類與賦值排序無關。計量數據的檢測結果以M（P25，P75）表示，行非參數檢驗；計數資料以例（%）表示，比較行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 廣東省臍血庫公共庫臍血的臨床應用情況2007-2020年廣東省臍血庫公共庫臍血的臨床應用情況及相關質量指標見表1，公共庫臨床應用臍血1 815例，其中用于治療惡性血液疾病1 024例（56.4%），非惡性血液病560 例（30.9%），免疫缺陷病82 例（4.5%），代謝性疾病56 例（3.1%），科研類應用93 例（5.1%）。不同臨床應用分類的應用地區、性別、年齡、TNC、輸注細胞數、治療類型和HLA 配型情況差異有統計學意義（P＜0.01）。華南、華東、華北的應用數量明顯高于華中、東北、西北、西南地區，華南非惡性血液病和惡性血液病的臍血應用明顯高于其它地區。受臍血治療的男性顯著多于女性。代謝性疾病和免疫缺陷病的患病年齡顯著低于其他疾病，用于移植治療的數量顯著高于其他疾病分類，6/6 配型的HLA 配型情況顯著高于其他疾病，輸注細胞數顯著高于其他疾病。

表1 廣東省臍血庫的臍血應用情況（n=1815）Tab.1 Application characteristics of Guangdong public UCB bank samples 例（%）

對廣東省臍血庫公共庫出庫的臨床應用類臍血的應用數據與隨訪的總生存率的分析見表2。數據結果顯示，不同生存率與植入情況之間差異有統計學意義（均P＜0.01），臍血植入成功顯著提高生存率。2年總生存率與疾病分類、治療類型和植入情況之間差異有統計學意義（均P＜0.01），非惡性血液病的生存率最高，惡性血液病次之，代謝性疾病再次，免疫缺陷病最低；輸注輔助治療的生存率比移植治療高。

表2 臍血臨床應用情況與總生存期的單因素分析Tab.2 ANOVAanalysis of overall survival and characteristics of clinical therapeutic cord blood samples

2.2 廣東省臍血庫公共庫臍血應用總生存曲線選取廣東省臍血庫公共庫應用的臍血中2年隨訪數據完整的數據進行總生存率分析并輸出總生存曲線圖（圖1）。數據顯示，非惡性血液病的2年總生存率為83%，惡性血液病為71%，代謝性疾病為66.7%，免疫缺陷病為69.8%。

圖1 廣東省臍血庫臍血治療的生存曲線Fig.1 Survival rates of therapy of Guangdong UCB bank samples

2.3 廣東省臍血庫自體庫臍血臨床應用情況廣東省臍血庫自體庫臍血應用包含自存自用、自存后同胞間使用以及自存后直系親屬使用三類。2007-2020年廣東省臍血庫自體庫臍血出庫應用于惡性血液病6 例，非惡性血液病170 例，免疫缺陷病2 例，糖尿病13 例，神經母細胞瘤2 例，再生醫學方向124 例，見表3。

表3 廣東省臍血庫自體臍血應用情況（n=317）Tab.3 Application data of Guangdong private UCB bankM（P25，P75）

3 討論

本研究數據資料顯示，血液病的治療（87.3%）仍然是目前臍血應用的主要方向，且主要治療方式是臍血移植。而異基因臍血用于治療代謝性疾病和免疫缺陷的病例較少；由于相關管理辦法，異基因臍血及相關成分目前也較少應用于臨床科研研究。近年來隨著對臍血應用的研究加深，臍血除了作為移植用的醫療資源，也可用以輸注作為輔助治療資源，通過拓寬適應證的途徑提高臍血治療應用的效率。LI 等［8］的研究就開發出了一種利用異基因臍血作為補充移植的外周血造血干細胞移植技術治療重癥地中海貧血和白血病［8］。本研究顯示惡性血液病的臍血治療中有73.5%臍血移植，26.5%是臍血輸注，而非惡性血液病的臍血治療的相應比例為63.8%和36.3%，證明了臍血不僅可用于移植治療血液病，更可作為輔助補充的營養細胞協助外周血造血干細胞移植和骨髓造血干細胞移植，具有極高的應用價值。對于科研類臍血應用，82.6%的臍血用于輸注輔助治療疾病，這些臍血都根據臨床試驗路徑開展研究。一項臨床研究表明，異基因臍血的輸注對缺血性中風患者沒有嚴重的不良反應，同時可以改善患者的神經和運動功能［9］。科研類臍血應用目前已用于再生醫療、糖尿病、腦性癱瘓、亞健康、外陰癌、肺癌、靜脈栓塞、老年癡呆、退行性病變、睡眠呼吸障礙、炎癥性腸病等11 個病種，研究的開展將有望擴大臍血治療的臨床適應癥，提高臍血的治療應用范圍。臍血中富含的各類干細胞已逐漸被醫生認識和并嘗試應用于臨床研究以期治療各類難治性疾病，這可歸因于臍血未經任何化學處理，安全可控，同時臍血中豐富的干細胞的旁分泌效應也使疾病的治療獲益。

除了異基因臍血的應用外，自體臍血也被用于臨床治療研究［10］。對于臍血庫自體庫應用情況，非惡性血液病的治療是目前自體臍血臨床應用的主要方向。由于廣東省是重型β 地中海貧血的高發地區，自體臍血亦被廣泛用于同胞間使用以治療重型β 地中海貧血。此外，自體臍血也開始用于部分白血病和重型再障的治療，其中白血病治療共6 例，2 例為同胞間使用，4 例為直系親屬使用；再生障礙性貧血共12 例，9 例為自存自用，3例為同胞間使用。近年來，由于自體臍血輸注的安全性和有效性，自體臍血應用治療腦癱逐漸成為了臨床應用研究的熱門［11-12］。SUN 等［13］進行了一項用自體臍血治療63 名腦癱兒童的研究，結果顯示自體臍血治療小兒腦性癱瘓是安全的，且能改善患兒的運動功能。DAWSON 等［14］也開展了一項使用自體臍血治療自閉癥兒童的臨床試驗，表明自體臍血輸注對自閉癥兒童是安全有效的，并且對自閉癥患兒在社交方面的行為有顯著的改善。廣東省臍血庫亦聯合廣東省婦幼保健院、深圳市兒童醫院、中山大學孫逸仙紀念醫院合作開展了自體臍血應用治療腦癱腦損傷的項目，并取得了一定的效果。廣東省臍血庫與廣東省婦幼保健院合作開展了早產兒自體臍血輸注的安全性研究，并做了10年長期隨訪驗證其安全性，通過進一步研究發現自體臍血輸注在預防和改善早產兒并發癥，如支氣管肺發育不良方面［15-16］有重要作用，能有效減少呼吸支持持續時間。有Ⅰ期臨床研究發現，自體臍血輸注治療兒童感音神經性聽力損失是安全且可行的［17］。自體臍血的治療應用拓展，也將為異基因臍血治療應用范圍的擴展奠定基礎。

本研究數據顯示，應用于不同疾病類型的臍血，其平均輸注細胞數均高于《造血干細胞移植技術管理規范（2017年版）》臍血輸注細胞數≥2×107/kg的要求，總生存期與TNC、TNC/kg、CD34+細胞數、患者年齡、患者體重和低溫保存時間無關，結果表明隨著臨床技術的發展，經篩選可使用于臨床的臍血質量優質，其治療應用可不再局限于小孩，亦能適用于成年人疾病的治療，且TNC、輸注細胞數均已能達到較高水平，然更多的TNC 和輸注細胞數并沒有明顯提高患者第1、2年的總生存率。而總生存時間與臍血的植入率（91.2%）之間差異有統計學意義（P＜0.05），說明植入率仍是影響總生存時間的主要因素。臍血移植后的移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）的程度是影響移植后的總生存率的重要因素之一，有研究表明GVHD 的程度與高分辨HLA 配對情況有相關性［18-19］，目前臨床也已不再局限于該6 個位點的低分辨分型，越來越多的醫院均已要求提供臍血的高分辨分型，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLADRB、HLA-DQB、HLA-DPB 和KIR［20］。然而本數據顯示HLA 配對的情況與總生存率差異無統計學意義，可能與錄入的低分辨HLA-A，HLA-B 和HLADRB 配對位點數據不足以分析其與總生存率的關系有關。目前臨床醫生對臍血造血干細胞移植應用的主要顧慮在于，臍血的細胞量可能僅供小兒患者使用且僅能移植應用一次。本研究數據顯示，接受臍血造血干細胞移植的非惡性血液病患者年齡中位數為11 歲，惡性血液病患者年齡中位數為17 歲，最大接受治療的年齡為79 歲，這一數據說明，只要臨床指標合適，臍血造血干細胞移植適用于各種年齡段。誠然外周血造血干細胞與臍血造血干細胞的應用各有優缺點，但臍血造血干細胞確實為有需要的患者提供了更多的可能。

本研究具有一定的局限性，后續進一步的研究方向可從增加移植后白細胞植入時間、血小板植入時間、GVHD 發生等級數據、HLA 高分辨配型情況等方面著手，進一步完善數據，利用大數據深入分析其中的差異，為臍血的臨床應用提出有意義臍血選擇方案。相信隨著臍血在臨床應用方面研究的深入，臍血的臨床應用將更加廣泛，為患者提供更多的治療選擇。