川芎嗪對臍帶間充質干細胞移植缺血性腦卒中遷移率的影響及作用機制

曹慧玲 汪小蓉 朱小飛 張潔 錢世寧

南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科（南京 210029）

缺血性腦卒中嚴重威脅患者的生命，臨床以溶栓為主要治療手段，但溶栓具有時效性，超過時間則療效不佳，并且溶栓治療同時還會導致缺血部位的再灌注，有可能進一步加重神經細胞的損傷［1］。缺血再灌注引起的神經損傷給患者后期的生存質量帶來極大的困擾，因此，亟待找尋促進神經細胞再生修復進而恢復神經功能的治療手段。再生醫學在組織器官修復治療領域擁有良好的應用前景［2］，干細胞移植是再生醫學中重要的一部分，已成為當前熱門的治療手段，研究表明干細胞能有效促進損傷部位細胞的再生與修復，已在臨床上得到認可［3］，臍帶間充質干細胞取自廢棄的臍帶組織，具有細胞更加原始，自我更新及分化能力更強，免疫源性更低等特點，在移植治療中展現優勢。盡管如此，干細胞移植仍存在移植效率低以及倫理等方面的限制［4］，成為亟需解決的問題之一。另外，中醫藥博大精深，其在治療腦卒中方面也取得了顯著療效，川芎嗪作為臨床常用藥物之一，對缺血再灌注損傷的神經細胞有明顯的保護作用，促進腦卒中患者神經功能的恢復［5］。曾有研究報道中醫藥與干細胞聯合治療較單一手段療效更為顯著［6］。然而，國內有關川芎嗪與臍帶間充質干細胞聯合應用的相關研究較少，前期實驗中筆者也發現川芎嗪聯合臍帶間充質干細胞通過修復神經細胞及抑制炎癥反應治療缺血性腦卒中取得了良好的效果［7］，并且體外川芎嗪對臍帶間充質干細胞也有良好的促神經分化、促分泌及促轉移的作用［8］。川芎嗪處理可能成為解決干細胞移植效率低的有效手段，為進一步探討川芎嗪對于ucMSCs 移植遷移率的影響及其作用機制，本研究將川芎嗪預處理后的ucMSCs 移植入大鼠腦缺血再灌注模型（MCAO）中，并模擬體內微環境觀察藥物對干細胞移植后遷移定位的影響，為解決干細胞移植效率難題提供實驗數據，也為中藥與干細胞聯合治療的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料實驗動物為SD雄性大鼠（250～300 g），購自上海捷思杰實驗動物有限公司。實驗用藥物川芎嗪購自美國Sigma公司。實驗用細胞為攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的人臍帶間充質干細胞，購自美國Sciencell，Carlsbad 公司。PC12 細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株）購自南京凱基生物科技有限公司。Transwell 小室購自美國Corning 公司。

1.2 儀器與試劑生物熒光倒置顯微鏡（日本Olympus BX43）；生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS IX51）；蛋白成像系統（英國G：BOXChemiXR5，Syngene）；臍帶間充質干細胞培養液（7501）由美國Sciencell，Carlsbad 公司提供；SDF-1（BA1389，1∶100）和CXCR4（PA1237，1∶500）均由武漢博士德生物工程有限公司提供；GAPDH（KGAA002，1∶10 000）抗體由南京凱基生物提供；AMD3100 由美國Sigma 公司提供；SDF-1 抗體由英國Abcam 公司提供；IL-1β ELISA 試劑盒由南京凱基生物提供；DAPI 染色試劑盒（KGA215）、全蛋白抽提試劑盒（KGP250）和Western blotting檢測試劑盒（KGP1201）均由南京凱基生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組隨機選擇實驗動物分為6 組，每組各10 只。正常組：實驗大鼠不做任何處理；假手術組：造模過程中不阻塞大鼠中動脈；模型組：建立MCAO 模型，尾靜脈給予磷酸鹽緩沖液（PBS）；ucMSCs 組：尾靜脈注射GFP 慢病毒轉染人臍帶間充質干細胞（ucMSCs）2×106個細胞/只；ucMSCs +TMP 組：實驗前TMP（200 μmol/L）預處理ucMSCs 24 h，然后尾靜脈注射2×106個細胞/只；ucMSCs+TMP+ADM3100 組：實驗前TMP（200 μmol/L）預處理ucMSCs-GFP 24 h，再經100 μg/mL AMD3100 處理8 h，然后尾靜脈注射2×106個細胞/只。

1.3.2 建立大鼠缺血性腦卒中模型采用線栓法建立腦中動脈栓塞模型（MCAO），具體方法見參考文獻［7］，尾靜脈輸注細胞，7 d 后觀察各項指標變化。

1.3.3 熒光顯微鏡觀察攜GFP 干細胞的定位預處理：取冰凍組織切片4～5 μm，浸入1%的丙酮固定液，室溫固定5 min，晾干，PBS 浸洗3 min×3；滅活酶：每張切片滴加2 滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫（15～25 ℃）封閉10 min，PBS 浸洗3 次；封閉：滴加1%BSA 50～100 μL，室溫孵育20 min；抗原-抗體反應：滴加一抗（1∶100/500 稀釋）50～100 μL，37 ℃，濕盒孵育2 h，PBS 浸洗3 次；一抗二抗反應：滴加TRITC（1∶200 稀釋）二抗50～100 μL，37 ℃，避光孵育1 h；復染：每張片子滴加配制DAPI 染液50～100 μL，室溫避光放置5 min；封片：用防淬滅封片膠封片；觀察：熒光顯微鏡下觀察細胞中蛋白的表達情況，取3 個表達區域拍照保存。

1.3.4 Western blot 檢測目標蛋白Western blot檢測細胞遷移相關蛋白SDF-1 和CXCR4 的表達，具體方法參照文獻［8］。

1.3.5 Transwell 檢測細胞遷移應用PC12 細胞生長至80%融合后，加入200 μmol/L 的H2O2作用12 h后，去除培養基作為損傷PC12模型。Transwell檢測臍帶間充質干細胞的遷移能力，小室下層為損傷PC12 細胞或經200 μmol/L TMP 預處理后PC12細胞，上層為1×105ucMSCs，對照孔為未經TMP 處理的ucMSCs 細胞，試驗孔為200 μmol/L TMP 預處理24 h以及100 μg/mL AMD3100處理8 h的ucMSCs細胞，具體方法參照文獻［8］。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，多個時間點的行為評分數據采用重復測量方差分析，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尾靜脈移植ucMSCs 觀察TMP 對干細胞遷移的影響臍帶間充質干細胞（ucMSCs）呈成纖維細胞樣生長，經慢病毒轉染后，GFP 轉染率達85%以上（圖1A）；移植后攜帶GFP 的移植細胞遷移定位于損傷組織，且TMP 預處理組遷移細胞數量（IOD 2.9×105）遠遠高于未處理ucMSCs 組（IOD 0.4×105），拮抗劑作用后遷移細胞數則下降至IOD 1.6×105，結果差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1B）；蛋白表達顯示TMP 處理組和ucMSCs 組中SDF-1 和CXCR4 的表達均顯著增加，以CXCR4 升高更為顯著，且TMP 處理組明顯高于ucMSCs 組和拮抗劑組（P＜0.05），說明TMP 預處理提高了ucMSCs 的遷移效率，且與SDF-1/CXCR4 通路密切相關（圖2）。

圖1 TMP 對GFP-ucMSCs 遷移率的影響Fig.1 The effect of TMP on migration of GFP-ucMSCs

圖2 各組SDF-1/CXCR4 蛋白表達Fig.2 The expression of protein SDF-1/CXCR4 in each group

2.2 川芎嗪促進ucMSCs的遷移及作用機制以氧化損傷PC12 細胞作為誘導劑，Transwell 法檢測川芎嗪處理前后ucMSCs 的遷移情況，結果顯示TMP預處理后ucMSCs 的遷移數量由未處理的每區域20 個提高至88 個（P＜0.05），加入拮抗劑后數量降至每區域42 個（P＜0.05），并且Western blot 也證實TMP 處理后ucMSCs 的CXCR4 的表達水平顯著升高（P＜0.05），而且可以被拮抗劑所抑制，明確SDF-1/CXCR4 通路在川芎嗪促進ucMSCs 遷移中的作用機制。見圖3-5。

圖3 TMP 對ucMSCs 遷移的影響（損傷PC12 誘導）Fig.3 The effect of TMP on migration of ucMSCs（induced by injured PC12 cells）

圖4 CXCR4 的表達Fig.4 The expression of CXCR4

圖5 TMP 對ucMSCs 遷移率的影響（損傷PC12 誘導）Fig.5 The effect of TMP on mobility of ucMSCs（induced by injured PC12 cells）

2.3 川芎嗪修復PC12 細胞損傷改善干細胞遷移微環境損傷PC12 經川芎嗪處理后誘導能力下調，ucMSCs 遷移減少，CXCR4 表達下調，TMP 處理PC12 細胞后，其IL-β 的表達顯著降低，由17.2 降至13.5 pg/mL（P＜0.05），說明TMP 可以修復PC12，進而降低ucMSCs 的遷移，同時抑制受損細胞炎癥因子表達，改善移植微環境，見圖6、7。

圖6 TMP 處理損傷PC12 對ucMSCs 遷移率的影響Fig.6 The effect of injured PC12 pretreated by TMP on mobility of ucMSCs

圖7 TMP 降低PC12 炎癥因子IL-β 的表達水平Fig.7 The level of IL-β in PC12 cells was decreased by TMP treatment

3 討論

近年來，干細胞移植治療在缺血性腦卒中的應用上展現了其優越性［9-10］。有研究［11］顯示臍帶間充質干細胞在多種臨床疾病治療中顯示了良好的效果。為進一步提高ucMSCs 的移植效率，本次研究中采用傳統中醫藥與干細胞相結合的方式探討中藥的相關效用。實驗從體內體外分別觀察經川芎嗪預處理后的ucMSCs 的遷移能力以及川芎嗪對ucMSCs 移植微環境的影響。結果顯示攜帶綠色熒光蛋白的ucMSCs 移植入模型大鼠體內后會趨化至損傷部位發揮作用，但定位細胞數量較少，而川芎嗪預處理后的ucMSCs 經尾靜脈移植缺血性腦卒中大鼠后遷移定位于損傷腦組織的細胞比例顯著增加，加入趨化因子受體拮抗劑后，組織中移植細胞數量減少，表明川芎嗪預處理提高了ucMSCs 的遷移能力且可以被抑制。進一步研究發現預處理ucMSCs 移植腦組織中基質細胞衍生因子-1（SDF-1）及其受體CXCR4 的表達顯著高于未處理細胞移植組及其它組別，說明川芎嗪預處理后ucMSCs 遷移能力增強的作用機制與SDF-1/CXCR4 軸密切相關［12］。經分析，預處理后ucMSCs細胞自身表達CXCR4 蛋白增加，受損腦組織表達SDF-1 增加，由于CXCR4 是SDF-1 的受體，趨化更多的ucMSCs 向受損部位遷移，LI 等［13］也認為CXCR4 蛋白的高表達有利于MSCs 向缺血組織部位遷移，也有報道SDF-1/CXCR4 軸可以增強大鼠骨髓間充質干細胞的遷移，減輕神經元損傷和細胞凋亡［14］，而且有研究證實SDF-1/CXCR4 軸可通過PI3K/Akt 等信號通路促進干細胞遷移［15-16］。

為了進一步解釋體內實驗中產生的細胞遷移增加的現象，本研究在體外模擬體內進行細胞遷移實驗。由于缺血再灌注損傷中氧化應激導致神經細胞損傷是其病理機制中的重要因素［17-18］，受損細胞可能會分泌趨化因子定向誘導干細胞遷移，本研究在體外采用H2O2氧化損傷P12 作為誘導細胞，通過Transwell 觀察ucMSCs 遷移變化。實驗結果顯示經TMP 預處理后ucMSCs 誘導遷移的細胞明顯多于未處理ucMSCs，且此現象可以被CXCR4 的拮抗劑阻斷。蛋白結果證實TMP 預處理后ucMSCs 的CXCR4 蛋白表達顯著升高且可以被拮抗劑抑制。因此，筆者認為TMP 可能通過刺激ucMSCs 的CXCR4 表達來提高細胞的遷移能力。另外，本研究還比較了TMP 對損傷PC12 細胞的修復作用是否影響ucMSCs 的遷移，研究發現TMP 處理后的PC12 細胞分泌IL-1β 的水平顯著降低，遷移實驗也證實TMP 處理后的PC12 細胞的誘導能力下降，ucMSCs 遷移細胞減少。分析原因可能為IL-1β 作為炎癥因子對移植細胞的存活是不利的［19］，但也是誘導干細胞遷移的重要因子［20］，其表達水平下降提示PC12 的誘導能力下降，不能趨化更多的ucMSCs 發生定向遷移，說明TMP 的作用位點不同發揮的作用也不同，當作用于移植細胞則可以提高細胞的遷移率，而作用于受損組織則減少細胞的趨化，但可以改善移植微環境，有利于移植細胞的存活，此與前期實驗報道一致［5，7］。本項研究盡管證實TMP 通過調節SDF-1/CXCR4 顯著提高ucMSCs 的遷移效率，但對相關信號通路有待進一步的研究分析。

綜上所述，本實驗從體內外分別研究了川芎嗪對臍帶間充質干細胞遷移能力的影響，并發現其作用機制與SDF-1/CXCR4 軸密切相關，說明TMP 通過提高ucMSCs 的CXCR4 蛋白的表達進而提高ucMSCs 的遷移能力，同時TMP 還可以改善移植部位微環境，為在中醫藥領域找尋提高干細胞移植效率的途徑提供實驗依據。