土壤產氣腸桿菌的解磷特性及其對毛竹苗的促生作用

徐冰石，陳伏生，張林平，楊 豆，劉 仁，張 揚＊

(1. 江西農業大學，國家林業和草原局鄱陽湖流域森林生態系統保護與修復重點實驗室，江西 南昌 330045；2. 江西農業大學，江西省森林培育重點實驗室，江西 南昌 330045)

磷素是植物生長發育和產量提升所必需的大量營養元素之一，在植物生物合成、細胞分裂等生理生化過程中不可或缺[1]。土壤磷素主要是以有機磷和無機磷形式存在，磷素雖儲量大，但絕大部分磷被土壤中鐵鋁離子等金屬鰲合為難溶性磷酸鹽不易被植物吸收利用[2-3]。為滿足植物對磷的需求，往往需要施用大量磷肥，然而施用磷肥會帶來環境污染且易被土壤固定，造成磷肥利用率低[4]，當季利用率僅有10%～15%[5]。如何提高土壤磷庫中磷素利用率，從而緩解土壤磷缺乏和大量施磷肥的矛盾是研究熱點。解磷微生物在土壤磷循環過程中發揮著重要的作用，是破解土壤磷供應和植物磷需求矛盾的關注焦點。目前解磷微生物主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、 克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、曲霉菌屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）、小單胞菌屬（Micromonospora） 和鏈霉菌屬（Streptomyces）等[6]。研究證實解磷微生物可通過釋放有機酸、質子等酸解和酶解方式將土壤潛在磷庫中的無效磷轉化為有效磷供根系吸收而促進植物生長[7]。

毛竹（Phyllostachys edulis）主要分布于我國南方丘陵山區，是重要的經濟竹種[6]。隨著毛竹林面積擴大及間伐間隔期縮減，竹林資源質量下降，地力衰退，竹產業的可持續發展受到嚴重影響。研究顯示，磷是毛竹林豐產和生態系統穩定性的首要限制因子之一[7]。因此，分離出高效解磷細菌是解決南方丘陵山區磷素供應不足的可行途徑之一，研究團隊從毛竹林土壤中篩選出1 株具有解磷功能的產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），以往研究報道該菌株具有豐富的生物學特性，如具有ACC 脫氨酶活性[6]，但關于該菌株的解磷特性未深入研究，該菌株對毛竹生長及養分吸收的促進效果及機理尚不清楚，限制其進一步開發和利用。植物葉片的磷可分為無機磷、糖磷、核酸磷和殘留磷4 個組分，植株葉片的磷組分含量受環境的改變而發生改變，影響其葉片磷分配[8]。目前解磷微生物對植物葉片中不同形態磷組分的影響則未見報道。本研究擬在深入了解產氣腸桿菌在不同碳、氮源及環境因子等條件下的解磷特性的基礎上，通過盆栽試驗評估該解磷細菌對毛竹實生苗的促生作用，明確該菌株對毛竹根系磷吸收和葉片磷組分積累的調控機制，以期為該菌株研制成生物肥料時發揮其最佳解磷功效，改善竹林土壤磷素營養提供依據，也有望揭示該解磷細菌對毛竹的促生機理，為毛竹專用生物肥料的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、苗木、培養介質和培養基

產氣腸桿菌由本課題前期從毛竹根際土壤中篩選的具有解磷功能菌株，基因登錄號為KY780224，保存于江西農業大學森林保護實驗室；毛竹實生苗栽培于學校溫室大棚，苗齡90 d，溫室平均溫度28 ℃，濕度50%～70%，自然光照，竹苗試驗期為當年4—10 月份。基質土壤采自江西農業大學后山竹林紅壤土，有機質含量6.37 g·kg?1，全 磷 含 量0.24 g·kg?1，全 氮 含 量0.43 g·kg?1。苗木培養介質為土壤：沙子：蛭石以2∶1∶1 比例混勻。NB 培養基：10 g 蛋白胨，3 g 牛肉膏和5 g 氯化鈉，蒸餾水1 000 mL；NBRIP 培 養 基：5 g Ca3(PO4)2，10 g 葡 萄 糖，0.1 g (NH4)2SO4，5 g MgCl2，0.25 g MgSO4·7H2O，0.2 g KCl，1 000 mL 蒸餾水，pH 7.2～7.4。

1.2 不同碳、氮源對產氣腸桿菌解磷能力的影響

選用Ca2(PO4)3作為唯一磷源，NBRIP 培養基中其余成分不變，將蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉以10 g·L?1的比例分別加入NBRIP 液體培養基中作為單一碳源；NBRIP 培養基其余成分不變，將(NH4)2SO4、KNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉以10 g·L?1的比例分別加入NBRIP 液體培養基中作為單一氮源。在裝有50 mL 培養基的100 mL 三角瓶中接種1%的接種量，加入產氣腸桿菌種液。對照處理為不接菌，每個處理設置3 個重復。在25 ℃條件下震蕩培養3 d，發酵液離心10 min（4 ℃，10 000 r·min?1），采用鉬銻抗比色法測定發酵液中有效磷含量[9]。

1.3 環境因子對產氣腸桿菌解磷能力的影響

將10、20、30 和40 mL 的NBRIP 培養基分別裝入50 mL 三角瓶，使裝液量與三角瓶體積比分別為1/5、2/5、3/5 和4/5；NBRIP 培養基成分保持不變，利用稀鹽酸將培養基初始pH 分別調至1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5；分別按質量百分比濃度0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%和9.0%向NBRIP 培養基中加入氯化鈉，保持培養基成分不變，均按1%接種量分別接入菌株種子液進行震蕩培養。對照處理為不接菌，每個處理設置5 個重復。在25 ℃條件下震蕩培養3 d，發酵液離心10 min（4 ℃，10 000 r·min?1），采用鉬銻抗比色法測定發酵液中有效磷含量[9]。

1.4 不同磷源對產氣腸桿菌解磷能力的影響

按1：100 的接種比例，將菌株種子液分別接入以Ca3(PO4)2、FePO4、CaHPO4、AlPO4和植酸鈣（Calcium phytate）為唯一不溶性磷源的NBRIP 培養基中。對照處理為不接菌，每個處理設置5 個重復，在25 ℃條件下震蕩培養3 d，發酵液離心10 min（4 ℃，10 000 r·min?1），提取上清液后采用鉬銻抗比色法測定發酵液中可溶性磷含量[9]。

1.5 產氣腸桿菌對毛竹實生苗促生評價

在產氣腸桿菌活化后，用接種環挑取少量菌體于NBRIP 培養基中，28 ℃、180 r·min?1振蕩培養48 h。發酵液離心5 min（4 ℃，5 000 × g），將菌體在0.85%無菌生理鹽水中潤洗3 次，并調整菌懸液（108cfu·mL?1），制成液體菌劑；采用灌根法分別施用在毛竹根際土壤中，以等量無菌生理鹽水作為對照處理，每株20 mL 施用量（每個花盆種植1 株），花盆內徑18 cm，盆高度18 cm，每盆添加培養介質約3.0 kg。采用隨機區組設計試驗，每組處理均為4 盆，設置5 個重復，各處理均20 盆（株）。期間按時澆水，不添加任何肥料，正常管理。在溫室培養180 d 后，每個處理組內隨機取1 盆（株），累計每處理取5 盆（株），選擇晴朗的上午采用LI-6400 光合儀測定毛竹葉片凈光合速率；將毛竹從塑料花盆中取出并洗凈，用于測定毛竹苗高、地徑，在105 ℃條件下殺青30 min，75 ℃ 烘干至恒質量，測定其葉片生物量和總生物量，采用抖落法采集根際土壤[10]，用于測定土壤有效磷、銨態氮和硝態氮含量；收集所有根系，洗凈備用。用球磨儀粉碎毛竹根系和葉片，過孔徑0.5 mm 篩，用于測定根系和葉片全磷含量以及葉片不同磷功能組分含量。根據Close 等[11]的提取方法，用三氯乙酸（TCA）提取毛竹葉片不同形態的磷功能組分，測定無機磷、糖磷、核酸磷和殘留磷4 種磷組分含量。土壤和植物組織其他養分測定方法見參考文獻[12]。

1.6 數據處理

采用Origin 8.5 和SPSS 13.0 軟件進行數據處理和統計分析，采用單因素多重比較（Duncan法）分析解磷特性試驗數據，采用配對T 檢驗分析促生長作用試驗數據（P<0.05），采用Pearson法進行相關性分析。圖表中數據均為平均值±標準差（n=5）。

2 結果與分析

2.1 不同碳、氮源對產氣腸桿菌解磷能力的影響

不同碳源對產氣腸桿菌溶解Ca2(PO4)3能力的影響顯著（圖1A）。以葡萄糖和蔗糖為唯一碳源時，該菌株的溶解能力最強，分別為328.41 mg·L?1和337.76 mg· L?1；其 次 為 果 糖，解 磷 量 為272.59 mg·L?1；以可溶性淀粉為碳源時，產氣腸桿菌的解磷能力最低，為45.32 mg·L?1。不同氮源對產氣腸桿菌的解磷能力也影響顯著（圖1B）。以硫酸銨為唯一氮源時，該菌株的解磷能力最強，為318.42 mg·L?1；其 次 為 硝 酸 鉀，解 磷 量 為270.3 mg·L?1；以蛋白胨為氮源時，該菌株解磷能力最低，解磷量僅為25.25 mg·L?1。

注：不同字母表示處理間差異顯著（P <0.05）。下同。Notes: Different letters indicated significant difference among treatments at 0.05 level. The same below.

2.2 環境因子對產氣腸桿菌解磷能力的影響

不同環境條件下產氣腸桿菌對Ca2(PO4)3的溶解能力有顯著差異（圖2）。在裝液量/體積比為1/5 和2/5 時該菌株具有較強的解磷能力，解磷量分別為314.92 mg· L?1和321.41 mg·L?1，裝液量/體積比為3/5 和4/5 時，該菌株也具有較好的解磷能 力，解 磷 量 分 別 為297.16 mg·L?1和236.43 mg·L?1（圖2A）。初始pH 對產氣腸桿菌的解磷能力有顯著影響，初始pH 值越大，解磷能力越強，當初始pH 值5.5 和6.5 時，該菌株具有較強的 解 磷 能 力，解 磷 量 分 別 為307.2 mg·L?1和318.82 mg·L?1，其次為初始pH 值4.5、3.5 和2.5時，在初始pH 值1.5 時解磷能力最低，解磷量為125.6 mg·L?1（圖2B）。隨著NaCl 濃度升高，產氣腸桿菌的解磷能力呈下降趨勢，在NaCl 濃度為0 和1.0 g·L?1，該菌株解磷能力最大，解磷量分別為331.45 mg·L?1和328.72 mg·L?1，顯著高于其它處理（圖2C）。

圖2 不同裝液量（A）、pH（B）和NaCl 濃度（C）條件下產氣腸桿菌在25 ℃震蕩培養7 d 時培養液可溶性磷含量Fig. 2 Soluble phosphorus concentrations in culture liquid ofEnterobacter aerogenescultivated 7 days under 25 ℃ in different liquid volume in flask (A)，pH (B) and NaCl (C) levels

2.3 產氣腸桿菌對不同磷源的溶解能力

產氣腸桿菌對5 種難溶性礦質鹽的溶解能力有顯著差異（圖3）。該菌株對CaHPO4和Ca2(PO4)3的溶解能力最強，解磷量分別為345.91 mg·L?1和331.83 mg·L?1，對FePO4和AlPO4也具有較好的溶 解 能 力，其 解 磷 量 分 別 為253.61 mg·L?1和203.65 mg·L?1，對植酸鈣的溶解能力最弱，其解磷量為179.63 mg·L?1（圖3A）。在對5 種磷源的溶解過程中，培養基pH 均顯著下降（圖3B）。相關性分析表明，發酵液pH 和產氣腸桿菌對不同磷源的解磷量呈顯著負相關（r=?0.54,n=25）。

圖3 不同磷源下產氣腸桿菌在25 ℃震蕩培養7 d 時發酵液pH 值和可溶性磷含量Fig. 3 Fermented liquid pH and soluble phosphorus concentration in culture liquid ofEnterobacter aerogenescultivated 7 days under 25 ℃ in different phosphorus sources

2.4 產氣腸桿菌對毛竹土壤有效養分和土壤酶活性的影響

與對照相比，施用產氣腸桿菌顯著提高了土壤中有效磷含量，增幅為50.6%，而對根際土壤銨態氮和硝態氮含量無顯著影響（表1）。施用菌劑顯著增強了土壤酸性磷酸酶和脲酶活性，增幅分別為20.6%和21.0%；而對堿性磷酸酶和過氧化氫酶無顯著影響（圖4）。

表1 接種產氣腸桿菌對毛竹土壤有效養分含量的影響Table 1 Effect of addingEnterobacter aerogeneson soil available nutrients of moso bamboo seedlings

2.5 產氣腸桿菌對毛竹根葉磷含量、葉片磷功能組分和實生苗生長的影響

與對照相比，施用產氣腸桿菌顯著提高了根系磷和葉片核酸磷含量，增幅分別為21.7%和11.6%，顯著降低了葉片殘留磷含量，降幅為5.5%；而對葉片全磷、無機磷和糖磷含量無顯著影響（圖5）。與對照相比，施用產氣腸桿菌菌劑顯著提高毛竹實生苗的苗高、地徑、生物量和葉片凈光合速率，增幅分別為30.9%、23.4%、44.4%和42.1%（表2）。

表2 接種產氣腸桿菌對毛竹實生苗生長指標的影響Table 2 Effect of addingEnterobacter aerogeneson the growth variables of moso bamboo seedlings

圖5 施用產氣腸桿菌對毛竹實生苗根葉磷和葉片磷組分含量的影響Fig. 5 Effect ofEnterobacter aerogenesinoculation on root total phosphorus and leaf phosphorus functional fractions of moso bamboo seedlings

2.6 毛竹葉片磷組分與各測定指標間的相關性

Pearson 相關性分析結果顯示，葉片磷組分與土壤理化性質和生長指標相關性不盡一致，其中葉無機磷和葉糖磷與土壤理化性質和生長指標并無相關性，葉核酸磷與土壤有效磷、土壤酸性磷酸酶、植株凈光合速率、植株生物量、葉生物量和根系全磷呈顯著正相關；葉殘留磷與土壤有效磷、土壤脲酶、植株凈光合速率、植株生物量、葉生物量和根系全磷呈顯著負相關；葉全磷、pH 與核酸磷呈顯著負相關，與殘留磷呈顯著正相關（表3）。

表3 葉片磷組分與各測定指標之間的相關性Table 3 Correlation coefficients between leaf phosphorus fractions and each measured index

3 討論

3.1 不同碳、氮源及環境因子對產氣腸桿菌解磷能力的影響

碳、氮源是解磷微生物必不可少的能源物質，不同種類的碳、氮源對解磷微生物生長代謝及溶解難溶性磷酸鹽的能力有著顯著影響[13]。研究顯示，解磷微生物可通過葡萄糖氧化代謝途徑分泌有機酸來溶解難溶性磷酸鹽[14]，分泌物中的某些糖成分可作為信號分子提高細菌磷酸酶相關基因的表達[6]。本研究結果發現，產氣腸桿菌在碳源為蔗糖或葡萄糖時對磷酸鈣的溶解效果最好，推測可能是該菌株能更有效的吸收利用這2 種糖分來提高磷酸酶相關基因的表達，或進入氧化代謝途徑，進而更好地促進溶解難溶性磷源。氮是構成微生物細胞核酸和蛋白質等遺傳物質的重要元素，對解磷微生物的生長繁殖和代謝也有著重要的影響[7]。Wenzel[15]發現解磷細菌在氮源為NH4+時對Ca2(PO4)3具有較強的溶解能力，而氮源為NO3?對Ca2(PO4)3幾乎沒有溶解能力。本研究結果顯示，產氣腸桿菌在氮源為NH4+和NO3?時對磷酸鹽均具有較好的溶解能力，這表明該菌株對氮源的可利用范圍更寬泛，適應性也較強。以往研究表明，培養基中鹽濃度、初始pH 值和接種量均能顯著影響解磷微生物對難溶性磷源的溶解能力[16-17]。Zeng[18]對解磷細菌JWSD2 進行解磷特性研究發現，不同裝液量、初始pH 值和不同鹽濃度對該菌株的解磷能力有著顯著影響，證實了環境因子對解磷微生物有顯著的影響。我國南方丘陵山區土壤環境因子較為復雜，如土壤酸度和氧氣濃度變化較大，本研究結果顯示，產氣腸桿菌具有良好的耐酸性和耐鹽性等功效，具有適應不同土壤環境因素的潛力。

解磷微生物的解磷機制不盡相同，有學者認為解磷微生物可通過分泌有機酸（草酸、蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖酸等）降低土壤pH，促進難溶性磷的溶解[19]，也有學者認為解磷微生物能與土壤中Fe3+、Al3+、Ca2+等陽離子螯合，通過與磷酸根離子競爭土壤中相同的吸附位點，釋放磷酸根離子[16]。此外，還有部分學者認為解磷微生物可以通過釋放磷酸酶活化土壤有機磷，使固定態磷向生物有效態磷轉變[20]。本試驗結果發現產氣腸桿菌對無機磷源鈣磷、鐵磷、鋁磷和有機磷源植酸鈣等磷源的溶解有顯著差異，在溶解這5 種不同磷源過程中，發酵液pH 也存在顯著差異，這和以往部分研究結果一致[21]，推測該菌株對不同類型的難溶性磷酸鹽可能具有不同的溶解機制。解磷微生物可通過分泌有機酸和質子絡合來溶解難溶性鈣鹽，如Wei等[22]發現部分解磷細菌主要通過分泌草酸來溶解土壤中難溶性磷源。此外，解磷微生物也能通過絡合作用來溶解鐵磷和鋁磷[1]。本試驗產氣腸桿菌對這5 種不同難溶性磷酸鹽的溶解能力差異是否因分泌有機酸或各種酶類的差異還有待進一步研究。毛竹主要分布于我國南方丘陵地區，該地區土壤中無機態磷主要以閉蓄態鐵磷和鋁磷為主，鈣磷次之，本試驗中產氣腸桿菌對難溶性無機磷和有機磷均有較好的溶解能力，顯示該菌株對不同類型土壤具有一定的適用性，這為今后該菌株應用于不同土壤類型發揮其解磷功效提供了潛能，也具備成為今后開發竹林生物肥料提高優良解磷菌株的潛力。

3.2 產氣腸桿菌對毛竹苗期促生長作用及影響因子

土壤磷有效性能顯著影響植物根系發育和植物生長[23]，解磷菌能夠提高土壤磷有效性和植物吸磷量，提高植物生物量，在土壤磷循環過程中有著重要調控作用[24]。本試驗結果顯示，施用產氣腸桿菌能顯著提高土壤有效磷養分，增加毛竹根系磷含量，提高毛竹實生苗生物量，這為今后開發竹林生物肥料提供優良的解磷菌株。諸多研究指出，解磷微生物對植物有較好的促生效果，然至今促生機理尚不明確[25]。部分報道解磷微生物可直接分泌小分子有機酸，通過酸類物質的羧基與金屬離子發生螯合作用和產生磷酸酶類物質提高土壤磷素利用率，促進植物生長[26]，也有部分研究結果表明，解磷微生物通過調控植物根際土壤有效養分來影響植株地上部分養分含量，而不是依靠溶磷微生物溶解土壤中難溶性磷源[27]。本實驗結果顯示施用解磷細菌產氣腸桿菌能顯著增強土壤中磷酸酶和脲酶活性，說明解磷菌劑能通過影響土壤酶活來提高土壤有效磷含量，這也驗證以往研究中證實的解磷菌可通過改變土壤酶活來提高土壤磷有效性[28]，而該菌株能否通過酶活性來影響土壤銨態氮和硝態氮含量還有待于進一步長期觀測。毛竹主要分布我國南方丘陵山區，該地區多為酸性紅壤，土壤有效磷含量較低，使得磷素成為限制毛竹林生產力提升的主要因子[29]。施用產氣腸桿菌顯著提高毛竹根際土壤有效磷、土壤酸性磷酸酶、根系磷含量，說明施用解磷菌株產氣腸桿菌能通過影響土壤有效養分和竹苗養分促進其生長發育。此外，施用產氣腸桿菌能顯著提高毛竹實生苗根系磷含量，對毛竹葉片全磷含量無顯著影響，說明施用解磷菌劑能提高毛竹對磷的吸收利用，可是仍難以滿足毛竹高速生長過程中對磷的需求，推測毛竹生物量的增加過程中稀釋了葉片磷素的含量，從而導致毛竹葉片中磷素含量無顯著變化。

為適應低磷土壤，植物會對葉磷組分再分配來維持其較高的磷利用效率和光合作用[7,30]。以往研究結果顯示，解磷菌能提高植物葉片磷含量[27]，而對葉片中不同磷組分含量有何影響卻尚未見報道。無機磷和糖磷是植物葉片代謝活躍的磷，核酸磷是植物組織中最大的有機磷庫，參與遺傳信息和蛋白質的合成，是植物進行再分配的主要磷庫[31]。在缺磷土壤的森林生態系統中，植物會調節葉片中不同磷組分重新分配，以維持光合作用效率，適應不同低磷土壤環境[30]。Schachtman[32]發現，植物葉片中核酸態磷被用于維持細胞內的胞質磷含量，隨著植物生長速度變化，胞質磷能顯著地影響葉片的光合作用速率。本研究發現施用解磷菌劑毛竹葉片核酸態磷含量顯著提高，殘留磷含量顯著降低，核酸態磷與毛竹葉片凈光合速率呈顯著正相關性，這表明在土壤磷限制下，產氣腸桿菌能提高葉片中用于蛋白質和酶合成的核酸磷含量，促進殘留磷向核酸磷轉化，保證葉片光合作用及其生理需求，在低磷的土壤環境中維持相對穩定的光合速率。目前需要進一步的試驗來闡明葉片殘留磷組分的功能作用，用以解釋在本研究中施用解磷菌劑導致凈光合速率與殘留磷呈負相關性。相關分析表明，土壤有效磷、毛竹根系全磷、生物量與葉片中核酸磷含量呈顯著正相關，與殘留磷呈顯著負相關，表明施用產氣腸桿菌能有效調控毛竹葉片中不同磷組分含量來促進植株磷利用效率，進而促進毛竹的生長和植株生物量的提高。以往研究也證實植物可通過調控葉片磷組分含量來適應缺磷土壤[7]。Mo[33]等人通過野外控制試驗證實施用磷肥能提高植物葉片的無機磷、糖磷和核酸磷含量，植物調控葉片中不同磷組分含量的分配來滿足光合作用對磷的需求。本試驗結果揭示了土壤解磷細菌產氣腸桿菌對毛竹根際土壤有效養分含量和葉片磷組分特征的影響，在解磷細菌對毛竹的促生機制方面提供了解釋，為改善毛竹林土壤有效養分利用提供了參考，也為今后生物磷肥的開發及竹林可持續發展提供理論依據。