光學參數對LED光療抑制口腔疾病常見細菌增殖的影響

胡嘉參，陰慧娟*，董曉曦，方 翔

（1. 中國醫學科學院北京協和醫學院生物醫學工程研究所，天津 300192；2. 安徽恩迪亞智能科技有限公司， 銅陵 244199）

許多口腔炎癥，如牙周疾病、根管感染等，多是由口腔中的細菌感染所致。細菌及其產物是導致根管及牙周炎癥發生、發展和傳播的主要因素，其中革蘭氏陰性菌的脂多糖和革蘭氏陽性菌的磷壁酸在致病過程中發揮著重要作用。在這些口腔細菌中，革蘭氏陰性的牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）和革蘭氏陽性的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）最為常見［1-5］。有效減少甚至清除口腔中的這些致病菌對于治療及預防口腔感染性疾病至關重要。傳統減少細菌載量的方法包括通過機械和化學方法去除根管內大部分感染物的根管治療術，以及通過局部或全身應用抗生素的抗感染治療等，這些方法的效果受到醫生操作手法和耐藥菌群等多種因素的影響［3-4，6-7］。另外，抗生素等化學藥物對細菌生物膜穿透有限，當細菌以生物膜形式存在時，會導致細菌對這些療法的敏感性降低［8］。

近年來，一些替代療法逐漸發展起來，如激光殺菌術、光動力殺菌以及光療殺菌等。激光殺菌術利用激光產生的熱能殺傷細菌。Bergmans等［9］利用1064 nm的釔鋁石榴石晶體（neodymium-doped yttrium aluminium garnet，Nd:YAG）脈沖激光對糞腸球菌進行體外照射，殺菌率可達99.7%。光動力療法利用光敏劑受光激發后產生的光化學作用殺傷細菌［1，10-13］。O’Neill等［10］用632 nm的紅光激發光敏劑甲苯胺藍產生光動力效應，對多種口腔細菌形成的生物膜產生殺傷作用，殺菌率達到97.4%。這些方法不會像抗生素那樣產生耐藥性，是很有潛力的臨床治療方法，但也存在一定的局限性，如由于較高的功率，激光殺菌可能會對正常的口腔組織細胞產生不可逆的損傷；而光動力治療時，外源性光敏劑具有潛在的光毒性，且操作復雜。有趣的是，研究者發現一些細菌含有內源性卟啉［14-15］，可作為內源性光敏劑，在光照射下可產生相同的光動力效應，進而達到殺菌效果［13，16］。這種利用低功率光照進行殺菌治療的方法被稱為光療殺菌。隨著發光二極管（light emitting diode，LED）的發展，從上世紀90年代開始，陸續有LED光源等其他光源代替激光用于光療領域的研究。LED光源具有能耗低、光斑大、產熱少、壽命長、波長選擇范圍廣、成本低等優勢。同時，除了半峰寬外，其在輸出功率、峰值波長等參數上與激光已相近。除在照明、LED顯示等領域外，在光療領域中利用LED代替激光進行光療殺菌效應的研究近年來也有諸多報道［17-18］。但是在光學參數，如波長、功率密度和能量密度等的殺菌效果上，還未獲得一致性結果，不同細菌對LED光療的敏感性也有明顯爭議［19］。

本研究針對口腔感染最常見的兩種細菌，通過光學參數的不同組合方案，探索LED光療抑制口腔細菌增殖的最佳治療方案，為口腔細菌感染性疾病的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

波長分別為405 nm和455 nm的高通量LED光源由中國醫學科學院生物醫學工程研究所激光醫學實驗室自主研制。LED芯片購自山東晶泰星光電科技有限公司。高通量LED光源上共有60個LED照光單元，每4個為1組。7組的功率密度為10 mW/cm2，另7組的功率密度為40 mW/cm2，每組可設置不同的照光時間；另有1組不發光作為對照。Lambda35型紫外-可見光分光光度計（美國PerkinElmer公司）、FluoroMax-4型熒光分光光度計（日本HORIBA科學儀器事業部）、全光譜型激光掃描共聚焦倒置顯微鏡（LSM710，德國ZEISS公司）等儀器用于光譜檢測和熒光成像。無菌透明底黑色96孔板（3603，美國Corning公司）、2.5 L圓底立式厭氧培養袋、2.5 L厭氧產氣包、氯化血紅素、維生素K1、脫纖維羊血、厭氧血瓊脂基礎培養基（青島海博生物技術有限公司）、腦心浸出液肉湯（brian heart infusion，BHI）、瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）等用于細菌培養。LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability Kit活/死細菌染色試劑盒（L7012，美國Thermo Fisher Scientific公司）用于細菌增殖檢測。糞腸球菌（ATCC-29212）和牙齦卟啉單胞菌（ATCC-33277）由天津醫科大學口腔醫院惠贈。

1.2 培養基的配制

BHI液體培養基A：取BHI 38.5 g，加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，用于糞腸球菌培養。

BHI液體培養基B：每200 mL的BHI液體培養基A中加入1 mL（0.001 g） 氯化血紅素和1 mL（0.002 g）維生素K1，用于牙齦卟啉單胞菌培養。

BHI固體培養基：取BHI 38.5 g和瓊脂粉20.0 g，加熱攪拌溶解于1000 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至40～60℃時倒入無菌平皿中，待冷卻至室溫，培養基凝固，用于糞腸球菌培養。

厭氧血瓊脂基礎培養基：取厭氧菌瓊脂45.4 g，加熱溶解于1000 mL蒸餾水中，分裝每瓶 200 mL，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至45～50℃時在每200 mL培養基中加入10 mL脫纖維羊血、1 mL（0.001 g）氯化血紅素和1 mL（0.002 g）維生素K1，混勻，倒入無菌平皿中，待冷卻至室溫，培養基凝固，用于牙齦卟啉單胞菌培養。

1.3 細菌培養

糞腸球菌接種到BHI固體培養基中，置于37℃，厭氧環境下培養24 h，挑選出單菌落轉移到BHI液體培養基A中，置于37℃，厭氧環境下培養繁殖至對數生長期，調節菌液濃度約108CFU/mL用于光照試驗。牙齦卟啉單胞菌接種到厭氧血瓊脂基礎培養基中，置于37℃，厭氧環境下培養5～7 d，待培養基表面長出黑色菌落后，挑選出黑色單菌落轉移到BHI液體培養基B中，置于37℃，厭氧環境下培養繁殖至對數生長期，調節菌液濃度約108CFU/mL用于光照試驗。

1.4 光照處理與分組

取對數期生長的細菌（菌懸液濃度約為108CFU/mL）接種于96孔板，每組4個復孔，每孔30 μL，LED光源從96孔板底部向上垂直照射細菌。照光方案如表1所示，功率密度為10 mW/cm2和40 mW/cm2，光照時間依次為16、24、32、40、48、56 min（或4、6、8、10、12、14 min），對應的能量密度為 9.6、14.4、19.2、24.0、28.8、33.6 J/cm2。同時設置不照光對照組。

表1 光照方案Tab. 1 Irradiation scheme

1.5 光療殺菌效果的檢測

1.5.1 即時殺菌效果

將光照后的細菌進行活死細菌熒光染色并涂片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察殺菌效果。具體操作步驟如下：細菌經不同光照處理后靜置30 min，每孔加3 μL染料SYTO9與碘化丙啶（propidium iodide，PI）的混合染液，避光孵育15 min；然后，每孔取5 μL菌懸液涂片；在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察并拍照，激發光分別為488 nm和543 nm；隨機選取4個視野，按如下公式計算細菌存活率。

細菌存活率（%）=活細菌數/細菌總數×100%。

1.5.2 抑制菌落生長效果

光照結束靜置30 min后，將每孔菌液梯度稀釋104倍，每孔取稀釋后的菌液5 μL進行固體培養基平板涂布。將涂布后的平板置于37℃，厭氧環境下繼續培養24 h，計數每組4個復孔的菌落數，計算抑菌率。

抑菌率（%）=（1-光照組計數/對照組計數）×100%。

1.6 細菌內源性卟啉測定

取糞腸球菌及牙齦卟啉單胞菌液各50 mL，濃度為2×108CFU/mL，以5000 r/min在4℃中離心20 min。向下層菌體中加入20 mL的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA，TE）緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）重懸，重復2次，往菌體沉淀中加入1.5 mL乙酸乙酯與冰乙酸的混合液（體積比為3∶1），進行冰上超聲裂解菌體（超聲30 s，重復6次），離心20 min。棄去下層菌體碎片，留取上層液體，加入1 mL蒸餾水，渦旋振蕩，離心10 min，重復1次，棄下層水層，加入100 μL的3 mol/L鹽酸，溶解乙酸乙酯中的卟啉，再渦旋振蕩，離心10 min，收集上層液體進行卟啉的光譜分析［20］。

1.7 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件、OriginPro9.1軟件等對數據進行分析與作圖，各組數據用平均值±標準差（±s）來表示，組間數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 糞腸球菌的光療抑菌效果

2.1.1 光學參數對糞腸球菌的即時殺菌效果的影響

圖1顯示，在設定的光學參數下，光療干預對糞腸球菌均有顯著的殺傷效果（P＜0.05），且隨著光照劑量逐漸增加，細菌存活率總體呈下降趨勢。當光照劑量到達28.8 J/cm2時，殺菌效果均超過50%（除405 nm波長40 mW/cm2外）。405 nm波長10 mW/cm2光照56 min（光照劑量33.6 J/cm2）的即時殺菌效果最好，可達（84.29±4.85）%；455 nm波長40 mW/cm2光照14 min（光照劑量33.6 J/cm2）的即時殺菌效果可達（83.88±2.14）%。

圖1 光療對糞腸球菌的即時殺菌效果Fig. 1 Immediate bactericidal effect of phototherapy on E. faecalis（a）不同光學參數LED干預下活死細菌熒光圖像；（b）不同光學參數LED干預下細菌存活率。*P＜0.05。(a) Bacterial fluorescent staining at different optical parameters; (b) Survival viability at different optical parameters. *P＜0.05.

2.1.2 光學參數對糞腸球菌的菌落生長抑制效果的影響

圖2中結果顯示， 波長為405 nm時，光照劑量高于14.4 J/cm2的LED光照干預的菌落抑制效果與對照組相比有統計學差異（P＜0.05）。隨著光照劑量增加，抑菌率呈升高趨勢。在光照劑量相同的條件下，10 mW/cm2效果優于40 mW/cm2。10 mW/cm2照射56 min（33.6 J/cm2）抑制菌落生長效果最好，抑菌率可達（97.64±2.31）%。

圖2 光療抑制糞腸球菌菌落生長效果Fig. 2 Inhibitory effect of phototherapy on colony growth of E. faecalis（a）不同光學參數LED干預下細菌平板計數；（b）不同光學參數LED干預下抑菌率。*P＜0.05。(a) Bacterial plate counting at different optical parameters; (b) Bacteriostatic rate at different optical parameters. *P＜0.05.

波長為455 nm時，光照劑量高于19.2 J/cm2的菌落抑制效果與對照組相比有統計學差異（P＜0.05）。隨著光照劑量增加，抑菌率呈升高趨勢。光照劑量相同的條件下，兩種功率密度效果無明顯差異。當光照劑量達到28.8 J/cm2時，兩種功率的抑菌率均可達50%以上，40 mW/cm2照射14 min（33.6 J/cm2）抑制菌落生長效果最好，抑菌率可達（85.03±4.84）%。

2.2 牙齦卟啉單胞菌的光療抑菌效果

2.2.1 光學參數對牙齦卟啉單胞菌的即時殺菌 效果的影響

所有光照組均有顯著的殺菌效果（P＜0.05），且隨著光照劑量逐漸增加，細菌存活率呈下降趨勢，說明光照劑量越大殺菌效果越好（圖3）。功率密度為10 mW/cm2、光照劑量達28.8 J/cm2時，殺菌效果均可達到50%以上。功率密度為40 mW/cm2、光照劑量達24.0 J/cm2時，殺菌效果可達到50%以上。405 nm波長40 mW/cm2照射14 min（33.6 J/cm2）的即時殺菌效果最好，可達（95.55±2.39）%。

圖3 光療對牙齦卟啉單胞菌的即時殺菌效果Fig. 3 Immediate bactericidal effect of phototherapy on P. gingivalis（a）不同光學參數LED干預下活死細菌熒光圖像；（b）不同光學參數LED干預下細菌存活率。*P＜0.05。(a) Bacterial fluorescent staining at different optical parameters; (b) Survival viability at different optical parameters. *P＜0.05.

2.2.2 光學參數對牙齦卟啉單胞菌的菌落生長抑制效果的影響

試驗發現（圖4）：波長為405 nm、功率密度為10 mW/cm2時，光照劑量高于14.4 J/cm2有顯著的菌落抑制效果（P＜0.05）；功率密度為40 mW/cm2時，光照劑量高于9.6 J/cm2即有顯著的菌落抑制效果（P＜0.05）；隨著光照劑量增加，抑菌效果呈升高趨勢；光照劑量相同條件下，40 mW/cm2的抑菌效果略優于10 mW/cm2，40 mW/cm2光照14 min（33.6 J/cm2）時菌落抑制效果最好，抑菌率可達（96.05±1.80）%。

圖4 光療抑制牙齦卟啉單胞菌菌落生長效果Fig. 4 Inhibitory effect of phototherapy on colony growth of P. gingivalis（a）不同光學參數LED干預下細菌平板計數；（b）不同光學參數LED干預下抑菌率。*P＜0.05。(a) Bacterial plate counting at different optical parameters; (b) Bacteriostatic rate at different optical parameters. *P＜0.05.

波長為455 nm、功率密度為10 mW/cm2時，光照劑量高于19.2 J/cm2有顯著的菌落抑制效果（P＜0.05）；當功率密度為40 mW/cm2時，光照劑量高于9.6 J/cm2的菌落抑制效果與對照組相比有統計學差異（P＜0.05）。隨著光照劑量增加，抑菌率呈升高趨勢。光照劑量相同的條件下，40 mW/cm2的抑菌效果優于10 mW/cm2。40 mW/cm2光照14 min（33.6 J/cm2）抑制菌落生長效果最好，抑菌率可達（84.32±4.88）%。

2.3 兩種細菌光療抑菌效果比較

如圖5所示，405 nm波長40 mW/cm2光照抑制牙齦卟啉單胞菌增殖的效果明顯優于糞腸球菌，10 mW/cm2光照抑制兩種細菌增殖的效果差別并不顯著。

圖5 波長405 nm LED光療抑制兩種細菌增殖的效果Fig. 5 Inhibitory effect of 405 nm LED phototherapy on proliferation of both kinds of bacteria（a） 即時殺菌效果；（b）抑制菌落生長效果。*P＜0.05。(a) Immediate bactericidal effect; (b) Effect of inhibiting colony growth. *P＜0.05.

如圖6所示，455 nm波長抑制兩種細菌增殖的總體效果差別并不顯著（P＞0.05）。

圖6 波長455 nm LED光療抑制兩種細菌增殖的效果Fig. 6 Inhibitory effect of 455 nm LED phototherapy on proliferation of both kinds of bacteria（a）即時殺菌效果；（b）抑制菌落生長效果。(a) Immediate bactericidal effect; (b) Effect of inhibiting colony growth.

2.4 兩種細菌內源性卟啉的測定

紫外-可見吸收光譜中，兩種細菌在381 nm波長處均出現了較高的吸收峰，且牙齦卟啉單胞菌吸收峰強度為糞腸球菌的3.7倍（圖7）。牙齦卟啉單胞菌在510、539和638 nm處還有3個小吸收峰，而糞腸球菌則是在510 nm和539 nm處有吸收峰。牙齦卟啉單胞菌在405 nm處峰值強度約為455 nm處的8.0倍。熒光發射光譜中，在400 nm波長光激發下，兩種細菌在608 nm和677 nm處均出現熒光發射峰，且牙齦卟啉單胞菌熒光發射峰的相對強度為糞腸球菌的3.7倍。

圖7 兩種細菌的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜Fig. 7 Absorption spectra and fluorescence emission spectra（a）吸收光譜；（b）發射光譜。(a) Absorption spectra; (b) Fluorescence emission spectra.

3 討論

糞腸球菌是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，是難治性根尖周炎、根管再感染的主要致病菌，對大多數根管治療藥物和清理消毒的方法都具有一定的抗性，是目前根管治療中的棘手問題［21］。牙齦卟啉單胞菌是一種革蘭氏陰性專性厭氧菌，是引起牙周疾病的主要致病菌，感染后可引起牙周組織破壞、牙槽骨丟失，最終牙齒脫落［4，22-23］，其易產生抗生素耐藥性。

本研究選擇與口腔感染性疾病密切相關的兩種具有代表性的細菌作為研究對象，采用光療方法對兩種細菌進行體外殺菌試驗，觀察光療對兩種細菌的體外殺傷效果。研究結果顯示，兩種細菌都是在405 nm波長光照下抑菌效果最佳，這可能與兩種細菌中存在卟啉這種內源性光敏劑有關［20］。我們對這兩種細菌內的卟啉進行了光譜測定，發現兩種細菌的吸收峰與原卟啉Ⅸ有相似之處，但位置存在一定的差異。原卟啉Ⅸ的最大吸收峰在400～410 nm，兩個小吸收峰分別在550 nm和600 nm附近［20］。而本研究中兩種細菌的最大吸收峰在381 nm處，其他小吸收峰則在510、539和638 nm處，有明顯的藍移現象。兩種細菌在400 nm波長光激發下的發射峰與原卟啉Ⅸ一致，均在608 nm和677 nm處［17］。我們認為，兩種細菌中存在的可被光激發的物質除原卟啉Ⅸ外，可能還含有其他具有相似結構的卟啉類化合物，如糞卟啉等［20］。405 nm處光吸收度約為455 nm處的8.0倍，因此，在相同的光照劑量下，殺菌效果更加明顯。我們還發現牙齦卟啉單胞菌的最大吸收峰和兩個發射峰均約為糞腸球菌的3.7倍，說明與糞腸球菌相比，牙齦卟啉單胞菌中含有更豐富的卟啉類化合物，這也解釋了405 nm對牙齦卟啉單胞菌殺傷效果更好的原因。

雖然兩種致病菌都在405 nm波長33.6 J/cm2照射劑量下治療效果最佳，但功率密度和照射時間存在差異，牙齦卟啉單胞菌功率密度大，照射時間短，糞腸球菌功率密度小，照射時間長。其可能原因是牙齦卟啉單胞菌內存在更豐富的卟啉類化合物，在405 nm高功率密度下大量卟啉類化合物同時被激發，在較短時間內產生大量活性氧，并發生氧化級聯反應殺傷細菌；糞腸球菌內的卟啉類化合物相對較少，在405 nm低功率密度光照下，需經過長時間積累，產生足夠的活性氧以觸發氧化級聯反應，最終產生明顯的抑菌效果。

本研究中即時殺菌效果與菌落抑制效果結果相似。其中個別光照組的抑制菌落生長效果略優于即時殺菌效果，這可能是由于活死細菌染色時，有些受到光損傷的細菌細胞膜還保持完整，可被染成綠色，但功能受損無法繼續分裂繁殖形成菌落。這提示，在臨床治療中可綜合考慮即時殺菌效果和長期抑菌效果來選擇合適的治療方案。

405 nm波長光照對牙齦卟啉單胞菌殺傷作用已有相關研究證明［24-27］。Hope等［24］研究了405 nm光對牙齦卟啉單胞菌殺傷作用。與本研究不同，該研究采用功率密度更大（328.5 mW/cm2）的激光筆對細菌進行照射，照射30 s時，盡管光照劑量只有9.86 J/cm2，但已有90.2%的細菌死亡，當照射時間繼續增加至5 min（98.55 J/cm2），細菌死亡率達94.5%，并沒有比30 s時明顯增加。對比本研究，同為405 nm波長，功率密度更大的激光雖短時間內可達到明顯的殺菌效果，但治療結束時的最終殺菌效果并不優于LED，這與細菌內卟啉類內源性光敏劑含量有限有關，單純增加光照劑量不會持續增加殺菌效果。Fukui等［25］采用了與本研究光學參數（405 nm，50 mW/cm2）相近的LED對牙齦卟啉單胞菌進行研究，得出的結果也與本研究相似，照射1～5 min（光照劑量3～15 J/cm2）時，抑菌率在20%～40%。該研究還采用了405 nm、100 mW/cm2照射5 min（30 J/cm2）的光學參數，抑菌率約50%，明顯低于本研究405 nm波長40 mW/cm2照射14 min（33.6 J/cm2）的抑菌率，這可能與照射時間較短，總照射劑量未至飽和有關。

405 nm波長光照對糞腸球菌殺傷作用報道較少，且目前研究認為405 nm波長光照對糞腸球菌殺傷作用不明顯［1，24，28-29］，這與本研究結果存在差異。我們認為可能有兩個原因：一是這些研究中光照時間均較短，最長不超過5 min，雖然光照劑量達200 J/cm2，但短時間內光照過飽和，內源性卟啉激發效果有限，導致殺菌不明顯；二是在LED光照對糞腸球菌殺傷作用中，由卟啉類化合物激發產生的光動力效應可能不是唯一效應，存在其他機制共同參與完成殺菌［30］，故LED光療對糞腸球菌的殺傷機制仍需進一步探索。

除400～500 nm的藍光外，紅光也有殺菌效果。K?nig等［31］用632.8 nm紅光（功率密度100 mW cm2， 能量密度360 J/cm2）進行照射，痤瘡丙酸桿菌存活率為（58±9）%，牙齦卟啉單胞菌存活率為（59±10）%，殺菌效果不佳，且光學參數明顯高于藍光。從細菌內源性光敏劑的吸收光譜來看（圖7），藍光的吸收率明顯高于紅光。相同的輸出功率下，藍光的有效劑量高于紅光，但是考慮到藍光對人眼的傷害和波長對光在組織中的穿透深度的影響，有學者認為紅光更適合臨床［32］。我們認為對于牙周表面的感染性疾病，藍光在組織中的穿透深度（1～2 mm）已可滿足要求，但是對于牙周袋內的感染，可能紅光的殺菌效果更好。在下一步的研究中，我們將進行藍光和紅光殺菌效果的對比研究，為臨床治療提供更詳實的證據。由于紅外光不在卟啉類化合物的吸收峰值上［20］，因此目前尚無單獨應用紅外光的殺菌效果的研究。但紅外光聯合外源性非卟啉類光敏劑的殺菌效果的研究已見報道［33］，紅外光在口腔非感染性炎癥的治療上也有好的效果［34］。

綜上所述，LED光療對口腔常見致病菌牙齦卟啉單胞菌和糞腸球菌有顯著的抑菌效果，光學參數對其有顯著的影響，波長為405 nm、照射劑量為33.6 J/cm2時治療效果最佳。LED作為一種新型低成本光源，在口腔細菌感染的臨床治療中具有廣闊的應用前景。