核黃素對砷誘導小鼠心、肺、腦毒性損傷的保護效應

付偉祥，宋小超，趙利影，盧怡光，王俊東，張建海

（山西農業大學動物醫學學院，太谷 030801）

全球砷污染已成為一個嚴重的問題，數以百萬計的人通過飲水和食物接觸到高劑量的砷［1］。流行病學調查證實，接觸砷與皮膚病理、心血管疾病、糖尿病、發育性神經毒性和基因毒性有關［2］。砷暴露會干擾心肌細胞代謝，引起心臟線粒體損傷［3］，引起各種呼吸道疾病，增加肺癌的風險［4］。低水平的砷還會對大腦突觸的神經傳遞產生有害影響，進一步引起神經行為障礙［5］。無機砷在幾乎所有細胞和組織中都表現出急性和慢性毒性，會引起多器官衰竭［6］。因此，探索緩解砷中毒的方法刻不容緩。

核黃素（riboflavin，VB2）是B族維生素中的水溶性成員［7］，補充VB2對各種疾病治療（如敗血癥、缺血等）有輔助作用。同時，它還有助于降低人類罹患某些癌癥的風險。VB2因其抗氧化、抗衰老、抗炎和抗癌特性被廣泛研究［8］。最近的研究證明，VB2在小鼠異位心臟移植模型中降低了缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）后心肌的氧化應激［9］。我們最近的研究也證實了VB2對氟化物導致的大腦皮層形態損傷有明顯的緩解作用［10］。根據這些結論，我們推測VB2可能在砷中毒對心、肺和腦的損害中發揮作用。

因此，本研究建立了VB2干預砷暴露小鼠模型，對其心、肺和腦進行組織形態學觀察，探討VB2減輕砷導致器官組織損傷的可能性，進一步為砷中毒的機制和防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

48只5周齡ICR雄性小鼠購于山西醫科大學，體重20 g左右。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物的分組及染毒

48只5周齡雄性小鼠，適應性飼養1周后，隨機分為4組，每組12只，分別為對照組（蒸餾水）、砷組（20 mg/L As2O3）、核黃素組（20 mg/L VB2）、砷+核黃素組（20 mg/L As2O3+20 mg/L VB2）。17周后，稱取小鼠及其臟器的質量，計算臟體比。臟器系數＝臟器濕質量（g）/體質量（g）×100%。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色組織切片

采取部分組織于4%多聚甲醛（pH=7.2）固定液中固定48 h后用流水充分漂洗，進行修塊（厚度約0.3 cm，切片平整），經梯度酒精脫水、二甲苯透明和浸蠟后，用石蠟包埋組織，于切片機上切成5 μm的薄片。將其撈至干凈的載玻片上，并于56℃烤片直至蠟融化。梯度酒精脫水后，蘇木精染液染色5 min，自來水藍化20 min，伊紅染色30 s，最后經梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片，在光學顯微鏡下鏡檢觀察組織形態學變化并采集圖片。

1.2.3 數據處理

采用GraphPad Prism 8軟件進行數據統計，測定結果用平均值±標準差（x±s）表示。差異顯著性利用one-way ANOVA（analysis of variance）進行分析，*代表P＜0.05差異顯著，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001，****代表P＜0.0001差異極顯著（與對照組相比）。

2 結果與分析

2.1 VB2干預砷中毒小鼠心、肺和腦的臟器系數變化

由圖1a可知，與對照組相比，砷暴露不能改變小鼠心、肺以及腦的質量，但核黃素與砷共處理后小鼠肺的質量增加，與對照組相比差異極顯著（P＜0.0001）。圖1b結果顯示：砷暴露不能導致心、肺和腦的臟器系數改變，但核黃素與砷共處理可使得心、肺的臟器系數與對照組相比顯著增加（P＜0.05，P＜0.001）；核黃素處理組小鼠腦的臟器系數增加，與對照組相比差異顯著（P＜0.01）。

圖1 核黃素對砷中毒小鼠心、肺、腦臟器系數的影響Fig. 1 Effect of riboflavin on cardiopulmonary organ coefficient in arsenism mice（a）小鼠心、肺、腦質量的變化；（b）小鼠心、肺、腦臟器系數的變化。星號表示組間差異有統計學意義。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。(a) Changes of heart, lung and brain weight in mice; (b) Changes of cardiopulmonary and cerebral organ coefficients in mice. Statistical analysis of invasion capacity. The asterisks indicate a statistically significant difference. *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001, ****P＜0.0001.

2.2 VB2干預砷中毒小鼠心臟組織形態學的變化

從圖2a可以看出，對照組心肌纖維束排列整齊、緊湊，組織結構清晰可見。砷處理組心肌纖維收縮、彎曲，心肌纖維束間隙增寬。同時，核黃素的添加有效改善了這種現象，減少了心肌纖維的彎曲、紊亂，但沒有完全恢復至對照組狀態。核黃素處理組與對照組比較無明顯變化。圖2b結果顯示：砷處理組心肌細胞排列紊亂，體積增大，細胞間隙中纖維分離，甚至出現斷裂現象；添加核黃素后纖維斷裂消失，間隙增寬現象減輕。

圖2 核黃素對砷中毒小鼠心臟組織形態學的影響Fig. 2 Effects of riboflavin on cardiac histomorphology in arsenism mice（a）小鼠心臟組織形態學圖片（20×）；（b）小鼠心臟組織形態學圖片（40×）。(a) Morphological images of mouse heart tissue (20×); (b) Morphological images of mouse heart tissue (40×).

2.3 VB2干預砷中毒小鼠肺組織形態學的變化

由圖3a可見：對照組肺的結構正常，肺泡完整，大小肺泡清晰可見，由肺泡壁連接成網狀；砷處理組與對照組相比，肺泡壁增厚，多數肺泡腔縮小，有的肺泡破裂融合在一起，失去網狀結構；核黃素則明顯改善了砷導致的這些病理變化，使肺泡恢復正常狀態；核黃素處理組與對照組比較無明顯變化。圖3b結果顯示：砷處理組支氣管壁增厚，肺泡壁增厚，連接在一起，肺的形態基本消失；添加核黃素后支氣管清晰可見，與對照組無差異，肺泡壁增厚現象消失不見。

圖3 核黃素對砷中毒小鼠肺組織形態學的影響Fig. 3 Effects of riboflavin on lung histomorphology in arsenism mice（a）小鼠肺組織形態學圖片（20×）；（b）小鼠肺組織形態學圖片（40×）。(a) Morphological image of mouse lung tissue (20×); (b) Morphological image of mouse lung tissue (40×).

2.4 VB2干預砷中毒小鼠大腦皮層組織形態學的變化

如圖4a所示，對照組錐體細胞和膠質細胞清晰可見，排列緊湊、密集，呈現一定的方向性，細胞核清晰，染色明顯。砷處理組與對照組相比，細胞數量明顯減少，排列紊亂，較多的細胞核染色變淺，細胞輪廓模糊不清。添加核黃素后，細胞數量有所增加，細胞核染色清晰可見，但仍排列紊亂。核黃素處理組與對照組無異。由圖4b中可見，砷處理組大腦皮層錐體細胞與角質細胞形態模糊，很難分辨，細胞核發生腫大，染色明顯變淺，有的細胞溶解、消失。添加核黃素后，仍可見少量腫大的細胞，但與砷處理組相比有明顯改善。

圖4 核黃素對砷中毒小鼠大腦皮層組織形態學的影響Fig. 4 Effects of riboflavin on cortical histomorphology in arsenism mice（a）小鼠大腦組織形態學圖片（20×）；（b）小鼠大腦組織形態學圖片（40×）。(a) Histomorphological image of mouse brain tissue (20×); (b) Histomorphological image of mouse brain tissue (40×).

3 討論

砷可以廣泛地侵入機體各個器官或組織，損傷其結構和功能，導致機體嚴重受損。砷中毒會使心臟鈣穩態發生紊亂，降低心臟抗氧化功能和激活氧化應激，導致心臟毒性的發生［11］。同時，砷暴露可觸發大鼠肺組織發生炎癥反應，引起膠原纖維的沉積［12］。Amuno等［5］的研究表明，高砷地區動物大腦中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GPx）的活性水平偏高，大腦的抗氧化能力降低。Sharma等［13］的研究也表明，砷處理使白化病小鼠大腦脂質過氧化（lipid peroxidation，LPO）水平升高，谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平顯著降低。這些均表明，砷的毒性表現與氧化應激有關，砷進入機體后導致氧化和抗氧化失衡，有毒的自由基在富含磷脂的膜狀結構（如線粒體、內質網）中誘導連鎖反應和脂質過氧化，如細胞凋亡、壞死、鐵死亡和自噬等多種生物學過程，直接損傷細胞膜并產生許多次級產物，導致組織廣泛的細胞損傷［14］。這可能是砷引發各器官組織損傷的原因之一。

一些抗氧化劑，如紫檀茋、姜黃素、葡萄籽原青花素等也被報道可通過抗氧化等功能減輕砷中毒導致的某一組織器官損傷。但是否對砷中毒導致的多器官損傷起緩解作用還未可知，且有的抗氧化劑提取繁瑣或價格昂貴，不能有效地應用于臨床與實踐。VB2廣泛存在于各類食物中［15］，通過黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）和黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）的作用形式，在呼吸鏈的電子傳遞過程和各種酶促反應中發揮關鍵作用［16］。VB2在多種疾病損傷中有良好的治療作用［17］，可緩解小鼠心肌缺氧/缺血損傷［18］，改善脂多糖誘導的肺部炎癥等［19］。

本試驗對心臟、肺和大腦的臟器系數和組織形態學進行了綜合分析，發現VB2添加對砷中毒心臟和肺的損傷有顯著的緩解效果。VB2較好地改善了砷導致的大腦皮層神經細胞數量的減少的情況，這可能與VB2的抗氧化、抗衰老、抗炎、抗傷害等生物學功能有關，但具體作用機制有待進一步研究。