紅光/近紅外LED光療抑制疼痛相關機制的研究

易 斌，吳 昊，張涵旭，郭慶霞，何 軍，宋 楠，張鳳民，宋武琦*

（1. 北京創盈光電醫療科技有限公司，北京 1001762； 2. 哈爾濱醫科大學，人體自身免疫疾病診療技術國家地方聯合工程研究中心，哈爾濱 150081）

慢性疼痛包括多種類型，其中非特異性頸肩腰痛是指既找不到確切的組織結構、病理改變，又無法明確病因的頸肩腰背部疼痛，主要原因可能包括肌肉的勞損、肌筋膜炎、椎小關節紊亂等［1］。常在較長時間固定姿勢，如低頭伏案工作、受涼、異?；顒踊虍惓Ｊ芰蟀l生，表現為局部酸脹、鈍痛或刺痛，以及無力或發沉感，如未得到及時合適的治療或反復發作，易導致疼痛慢性化，并發牽涉痛以及頸、肩、腰背等部位功能障礙，嚴重影響工作效率和生活質量［2］。

目前，非特異性頸肩腰痛主要采取綜合康復治療，例如：手法按摩可以選擇性地進行軟組織松解術或關節松動術，以及深部肌肉刺激治療緩解筋膜炎和肌肉勞損［3］；口服或者外用非甾體抗炎藥物治療，并在醫師指導下進行運動康復治療等；超短波療法、激光、中頻電療等物理治療也廣泛用于臨床和社區［4-7］。

在炎癥相關慢性疼痛患者和動物模型中，局部組織和神經系統中的炎癥因子以表達升高為主，使用藥物或者其他輔助治療方法抑制炎癥因子或者進行鎮痛處理之后，炎癥因子的表達水平下降，且與患者或者動物模型中疼痛評分呈正相關［8-9］。本研究在前期研究的基礎上選取疼痛相關趨化因子和炎癥因子為指標，以正常人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和人單核細胞THP-1為研究模型開展體外細胞學試驗，以明確630 nm紅光和850 nm近紅外LED光療的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

本研究經哈爾濱醫科大學倫理委員會批準，取20～24歲健康男性志愿者的外周血，使用人淋巴細胞分離液提取PBMC進行后續光照處理和細胞因子檢測。人單核細胞THP-1購自中國科學院細胞庫。

1.2 儀器設備

發光二極管（light-emitting diode，LED）陣列式光源為北京創盈光電醫療科技有限公司制造（CY-1004C），光源紅光波長為630 nm、近紅外波長為850 nm。兩種波長的光同時照射，平均光功率密度為25 mW/cm2，其中630 nm和850 nm光的光功率密度比例為10∶1。

1.3 試劑

熒光定量PCR引物由黑龍江省博仕生物公司合成，具體序列見表1。逆轉錄試劑使用賽默飛世爾科技（中國）有限公司（Invitrogen）的SuperScript III Kit；熒光定量PCR試劑使用寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）的2×SYBR Premix Ex Taq；RNA提取試劑盒購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；人淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。具體操作參見試劑盒說明書。

表1 相關引物序列Tab. 1 Sequence of the primers

1.4 試驗分組

單核細胞THP-1用于評價光照劑量對細胞的安全性。22.5 J/cm2功率密度下分別照射3次和5次，最后一次光照結束后，細胞立即與細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）溶液孵育，37℃孵育2 h后，用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度。通過CCK-8試驗檢測細胞活性，并與對照組進行對比。將每位志愿者的PBMC分為對照組和LED組，共4例，LED組的細胞接受22.5 J/cm2的固定劑量照射5次，間隔90 min，對照組采用相同操作，但是不進行LED光療處理。最后一次照射30 min后，提取細胞總RNA，并進行熒光定量PCR檢測。

1.5 統計方法

所有數據用平均數±標準差（x±s）表示，采用Shapiro-Wilk檢驗進行正態性檢驗。所有試驗中差異的統計學意義均采用未配對t檢驗。每個分析的顯著性水平設為0.05。使用GraphPad Prism（5.0版）統計程序對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 紅光/近紅外LED光療對單核細胞活性的影響分析

為了評價紅光/近紅外LED光療對單核細胞活性的影響，常規培養THP-1細胞，接種鋪板24 h后選擇兩種方式進行LED照射：照射3次，每次15 min（22.5 mW/cm2），間隔180 min；照射5次，每次15 min（22.5 mW/cm2），間隔90 min。然后使用CCK-8法檢測THP-1的細胞活性。圖1結果顯示，上述劑量下LED光療對于單核細胞的活性沒有影響。因此，本文選擇對PBMC照射5次LED進行后續研究，其照射方式與上述THP-1細胞照射5次的方式相同。

圖1 LED光療后對單核細胞活性的影響Fig. 1 Effect of LED phototherapy on monocyte activity與對照組（NC）比較，固定劑量22.5 J/cm2照射3次和5次對THP-1細胞活性沒有明顯影響。ns：P＞0.05。Fixed dose 22.5 J/cm2 irradiation for 3 and 5 times had no significant effect on the activity of THP-1, compared with the control group (NC). ns: P＞0.05.

2.2 紅光/近紅外LED光療對PBMC主要疼痛相關趨化因子表達的影響

將PBMC接種在24孔板后常規培養，6 h開始照射第一次，一共照射5次，每次間隔時間為90 min，照射時間為15 min，照射劑量為22.5 J/cm2。末次照射30 min后，收取細胞并提取總RNA。熒光定量PCR檢測趨化因子mRNA的表達水平，發現PBMC中CXCL12、CXCL13和CX3CL1的基因轉錄水平顯著下調，CXCR1和CXCR2基因轉錄未見顯著變化（圖2）。

圖2 LED光療后PBMC主要疼痛相關趨化因子及受體表達情況Fig. 2 Expression of main pain related chemokines and receptors in PBMC after LED phototherapy（a）紅光/近紅外LED光療流程；（b）在PBMC中CXCL12 mRNA的表達情況；（c）在PBMC中CXCL13 mRNA的表達情況；（d）在PBMC中CXCL10 mRNA的表達情況；（e）在PBMC中CX3CL1 mRNA的表達情況；（f）在PBMC中CXCR1 mRNA的表達情況；（g）在PBMC中CXCR2 mRNA的表達情況。光照劑量為22.5 J/cm2，照射5次。ns：P＞0.05，*P＜0.05。(a) Red/near infrared LED phototherapy process; (b) CXCL12 mRNA expression in PBMC; (c) CXCL13 mRNA expression in PBMC; (d) CXCL10 mRNA expression in PBMC; (e) CX3CL1 mRNA expression in PBMC; (f) CXCR1 mRNA expression in PBMC; (g) CXCR2 mRNA expression in PBMC. The illumination dose was 22.5 J/cm2, 5 times. ns: P＞0.05, *P＜0.05.

在上述相同處理條件下，PBMC中CCL4基因轉錄水平顯著下調，CCL1基因表達水平沒有明顯變化，但CCR2基因轉錄顯著下調（圖3）。

圖3 LED光療后PBMC主要疼痛相關趨化因子及受體表達情況Fig. 3 Expression of main pain related chemokines and receptors in PBMC after LED phototherapy（a）在PBMC中CCL4 mRNA的表達情況；（b）在PBMC中CCL1 mRNA的表達情況；（c）在PBMC中CCL2 mRNA的表達情況；（d）在PBMC中CCL3 mRNA的表達情況；（e）在PBMC中CCR2 mRNA的表達情況；（f）在PBMC中CCR4 mRNA的表達情況。光照劑量為22.5 J/cm2，照射5次。ns：P＞0.05，*P＜0.05，**P＜0.01。(a) CCL4 mRNA expression in PBMC; (b) CCL1 mRNA expression in PBMC; (c) CCL2 mRNA expression in PBMC; (d) CCL3 mRNA expression in PBMC; (e) CCR2 mRNA expression in PBMC; (f) CCR4 mRNA expression in PBMC. The illumination dose was 22.5 J/cm2, 5 times. ns: P＞0.05, *P＜0.05, **P＜0.01.

2.3 紅光/近紅外LED光療對PBMC主要疼痛相關炎癥因子表達的影響

在上述相同處理條件下，經LED光療之后參與疼痛誘導的IL-4和IL-6基因表達顯著下調，IL-1β和IL-8基因的表達沒有明顯變化（圖4）。

圖4 LED光療后PBMC主要疼痛相關炎癥因子表達情況Fig. 4 Expression of main pain related inflammatory factors in PBMC after LED phototherapy（a）在PBMC中IL-4 mRNA的表達情況；（b）在PBMC中IL-6 mRNA的表達情況；（c）在PBMC中IL-1β mRNA的表達情況；（d）在PBMC中IL-8 mRNA的表達情況。光照劑量為22.5 J/cm2，照射5次。ns：P＞0.05，*P＜0.05，***P＜0.001。(a) IL-4 mRNA expression in PBMC; (b) IL-6 mRNA expression in PBMC; (c) IL-1β mRNA expression in PBMC; (d) IL-8 mRNA expression in PBMC. The illumination dose was 22.5 J/cm2, 5 times. ns: P＞0.05, *P＜0.05, ***P＜0.001.

2.4 紅光/近紅外LED光療對PBMC主要疼痛相關金屬蛋白酶表達的影響

在上述相同處理條件下，參與疼痛誘導的基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）的基因經LED光療之后其表達顯著下調，但MMP9和PTGR3基因表達沒有明顯變化（圖5）。

圖5 LED光療后PBMC主要疼痛相關金屬蛋白酶的表達情況Fig. 5 Expression of major pain related metalloproteinases in PBMC after LED phototherapy （a）在PBMC中MMP2 mRNA的表達情況；（b）在PBMC中MMP9 mRNA的表達情況；（c）在PBMC中PTGR3 mRNA的表達情況。光照劑量為22.5 J/cm2，照射5次。ns：P＞0.05， **P＜0.01。(a) MMP2 mRNA expression in PBMC; (b) MMP9 mRNA expression in PBMC; (c) PTGR3 mRNA expression in PBMC. The illumination dose was 22.5 J/cm2, 5 times. ns: P＞0.05, **P＜0.01.

2.5 紅光/近紅外LED光療調控疼痛作用機制

本試驗結果表明，紅光/近紅外LED光療可以有效降低PBMC中炎癥因子和趨化因子的表達水平，可通過炎癥因子和趨化因子對于神經疼痛敏感性的調節作用發揮鎮痛功能（圖6）。

圖6 紅光/近紅外LED光療調控疼痛作用機制Fig. 6 Mechanism of pain modulation by red/near infrared LED phototherapyGPCR：G蛋白偶聯受體；EGFR：表皮生長因子受體。GPCR: G protein-coupled receptors; EGFR: Epidermal growth factor receptor.

3 討論

光生物調節（photobiomodulation，PBM）是細胞吸收可見光和近紅外光譜范圍內的非電離光輻射，從而引發光物理和光化學過程的機制。光生物調節療法（photobiomodulation therapy，PBMT）是基于PBM原理的光子照射療法，可使用在可見和近紅外光譜中來自光源的非電離形式的光（包括激光、發光二極管和寬帶光）來引起生理變化和治療效果［10］。紅光和近紅外光由于具有良好的組織穿透性，已廣泛地應用于臨床物理治療。

目前認為，通過超短波、超聲等理療可以加速炎癥部位的血液循環，加快滲出液的吸收，從而達到消炎、鎮痛的目的。近年來LED光電設備作為低功率激光的替代品，越來越多地被應用于醫學實踐。大量研究表明，紅光和近紅外波段內的LED光源具有抗炎、組織修復等生物學功能［11-13］。臨床應用也發現，其對局部組織的消炎鎮痛具有良好的效果，但其鎮痛的分子機制目前還不是十分清楚。

疼痛本身可作為機體受到傷害時的一種警告，引發機體做出一系列防御性保護反應。由炎癥引起的慢性疼痛往往給患者帶來了難以忍受的折磨，并嚴重影響患者的生活質量。本研究通過紅光（630 nm）/近紅外（850 nm）LED光源對正常人PBMC進行照射，通過熒光定量PCR方法檢測疼痛相關細胞因子的表達，分析紅光/近紅外光對慢性疼痛的抑制作用機制。

本研究采用PBMC作為研究對象。它是血流中趨化因子和炎癥因子的主要來源，可用來模擬正常使用條件下光療照射部位血液和組織液中相關因子的表達水平；慢性炎癥局部單核細胞釋放的細胞因子可有效調控炎癥在組織局部引發疼痛。組織和神經來源的各種細胞因子對光照的反應還需要進一步進行深入研究。

趨化因子在機體發生炎癥、損傷及病原體入侵時，其表達含量增高，并向受損部位募集免疫細胞，使機體產生免疫應答。大量研究表明，趨化因子可通過外周和中樞敏化的雙重機制參與慢性疼痛［14］。CXCL12是一種肝素結合趨化因子，CXCL12/CXCR4在神經性疼痛的發病機制中是充分和必要的。阻斷CXCL12/CXCR4信號通路可能有助于緩解過敏性接觸性皮炎的瘙癢和疼痛感［15］。急性鞘內給藥CXCL12可直接誘導觸發大鼠機械過敏［16］。鞘內注射CXCL12中和抗體或CXCR4拮抗劑AMD3100可延遲機械異常疼痛的發生，并逆轉PSNL或SNI誘導的機械異常疼痛［17］。在疼痛大鼠模型中，CXCL13表達顯著上調，激活p38/ERK/AKT通路，從而對抗嗎啡的鎮痛作用［18］。CX3CL1與MMP9上調共同參與了坐骨神經慢性收縮損傷（chronic constriction injury，CCI）、大鼠機械異常痛和熱痛覺過敏的過程［19］。CX3CL1和CCL2的表達分別與下肢疼痛和腰痛的視覺模擬評分法（visual analogue scale，VAS）的評分呈正相關［20］。

CCL4與CCR1和CCR5結合，在部分坐骨神經結扎后，受損坐骨神經的巨噬細胞和雪旺細胞中的CCL3、CCL4、CCR1和CCR5顯著上調［21］。鞘內注射CCR2/CCR5拮抗劑可以減輕大鼠慢性結扎損傷模型的神經性疼痛，鎮痛藥物的使用也可以顯著下調CCL4的表達［22］。

本研究發現，給與紅光/近紅外光照處理后，PBMC中IL-4和IL-6的表達水平顯著下降，這一作用可以緩解局部無菌性炎癥引發的疼痛。項目組前期的研究也發現，630 nm 紅光LED照射可以抑制滑膜細胞和巨噬細胞的炎癥反應［11-12］。本研究采用正常人PBMC作為細胞模型，通過光照處理后，趨化因子和炎癥因子表達都有顯著下降。雖然是體外試驗，但可以部分地說明，紅光/近紅外光照處理可以有效抑制疼痛相關細胞因子表達，進而影響疼痛過程。

活化的星形膠質細胞釋放MMP2和MMP9誘導中樞敏感化并維持神經性疼痛。通過藥物下調MMP2和MMP9的表達可以上調結扎損傷模型鼠的疼痛閾值［23］。本研究發現，光照后PBMC中MMP2的表達水平顯著下降，提示其可能參與了抑制疼痛的過程。

綜上所述，炎癥因子和趨化因子對于神經疼痛的敏感性有調節作用，通過調控其表達可發揮鎮痛作用。本研究證明了紅光（630 nm）/近紅外（850 nm）LED光療可抑制PBMC中炎癥因子和趨化因子的表達，進而緩解疼痛。這一發現有望成為新的疼痛輔助治療手段。