腫瘤抗原肽M1-10的抑瘤活性研究

黃文強，卜會銅，裴超柱，黃明敏，譚擁軍

（湖南大學生物學院，長沙 410082）

全球疾病負擔研究顯示，大多數國家的惡性腫瘤發病率呈上升趨勢［1-2］，目前其主要的治療方式為化療和放療［3］。近年來，惡性腫瘤免疫治療這一新型治療方式備受關注［4］。腫瘤細胞通常特異性高表達一些蛋白或表達一些突變蛋白，這些蛋白質可在胞內降解成8至11個氨基酸組成的寡肽，通過人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）呈遞到癌細胞表面，引發T細胞響應而殺死細胞。這些寡肽被稱為腫瘤抗原。開發新的腫瘤抗原是提高腫瘤免疫治療水平的重要手段之一。目前，基于腫瘤抗原的腫瘤多肽疫苗已在多種惡性腫瘤中顯示出良好的抑瘤效果［5-6］，且與其他相關抗原［7］或免疫檢查點抑制劑共同使用時產生的治療效果更好［8-9］。

FOXM1是FOX轉錄因子家族的成員［10］，在許多惡性腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等中呈高表達，而在正常組織中不表達或低表達［11-14］，預示在多種惡性腫瘤中，FOXM1可能是腫瘤抗原的來源蛋白。目前針對FOXM1作為腫瘤藥物靶點的研究主要集中在對其轉錄活性功能進行抑制，從而阻遏細胞生長和誘導細胞凋亡［15］，而以FOXM1蛋白為對象開發抗腫瘤疫苗才剛剛起步。已有研究發現，FOXM1蛋白的特定肽段可以誘導機體產生HLA-A2限制性的細胞毒性T細胞響應；對宮頸癌患者進行臨床I期研究，將FOXM1（262～270）肽段與VEGFR1［12］、VEGFR2［12］、MELK［16］、HJURP［17］來源的四種抗原肽段聯合接種，引發T細胞響應且未發現劑量毒性，患者臨床反應良好，初步顯示其具有抗腫瘤療效。因此，以FOXM1蛋白為對象篩選腫瘤抗原并開發抗腫瘤疫苗，是腫瘤免疫治療研發的有效策略。

本課題組圍繞FOXM1與惡性腫瘤開展了分子機制研究和生物藥物開發［18］。在此基礎上，我們篩選得到FOXM1肽段（719～728）作為腫瘤抗原肽，命名為M1-10。通過細胞試驗和兩種小鼠乳腺癌模型開展了M1-10的免疫原性和抑瘤活性分析，證實了該肽的抑瘤效果，獲得了一種新的腫瘤抗原肽。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

二氯樹脂、氨基酸購于希施生物科技有限公司；二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）、哌啶（Piperidine，PIP）、N，N-二異丙基乙胺（N，N-Diisopropylethylamine，DIEA）、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（O-Benzotriazole-N，N，N'，N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate，HBTU）、二氯甲烷（dichloromethane，DCM）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、乙二硫醇（ethanedithiol，EDT）、三異丙基硅烷（triisopropylsilane，TIS）、無水乙醚、乙腈（色譜級）、無水乙醇、甲醇、異丙醇、吡啶等購于國藥集團化學試劑有限公司，不完全弗氏佐劑購自上海生工生物工程有限公司；Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、RP1640培養基以及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購于GIBCO公司；乳腺癌4T1細胞購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）；細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒以及Mouse IFN-γ ELISA試劑盒購自碧云天生物技術公司；小鼠淋巴細胞分離液、200目尼龍網購自達科為公司；BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，MMTVPyMT基因型小鼠購自邦耀生物公司。

多肽合成儀購買于希施生物科技有限公司；高效液相色譜儀購買于廣州睿栢儀器科技有限公司；AKTA蛋白純化儀購買于通用電器公司（General Electric Company，GE）；CO2細胞培養箱購買于美國Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購買于日本Nikon公司；微孔板檢測儀（酶標儀）購買于上海美谷分子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原肽的篩選

使用抗原表位預測軟件NetMHCpan和IEDB對FOXM1的C端相關肽段進行預測。篩選出與HLA-A2分子結合等級最高的抗原肽，通過分子模擬軟件Chimera 1.15繪制出抗原肽的分子結構。從PDB數據庫（https://www.rcsb.org/）中查找HLA-A2所對應的PDB文件并下載。通過三維分子模擬軟件PyMOL將篩選出的抗原肽擺放至HLA-A2分子結合口袋附近，并保存為PDB文件。通過分子對接軟件FlexPepDock預測出最優的結合模型，再通過數據處理工具Rosetta計算出兩者結合的重要參數。

1.2.2 抗原肽的合成、純化及鑒定

使用固相多肽合成儀分別合成M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2五種抗原肽，將合成的抗原肽粗品在蛋白純化儀上使用C18柱反向層析進行純化。對純化出的多肽進行質譜鑒定，再用高效液相色譜儀進行純度檢測，通過出峰面積百分比得出多肽質量濃度。

各抗原肽的序列信息如下。M1-10：ILLDISFPGL；MELK-87-7N：EYCPGGNLF；HJURP-408：KWLISPVKI；VEGFR1-1084：SYGVLLWEI；VEGFR2-169：RFVPDGNRI。

1.2.3 抗原肽對預免疫后小鼠淋巴細胞的增殖、 干擾素γ釋放以及殺傷作用的影響

將年齡為5周左右的BALB/c健康小鼠（Mus musculus）隨機分成4組，分別注射PBS、M1-10、4種抗原肽（HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）、5種抗原肽（M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2），以上4組均與不完全弗氏佐劑混合注射，進行預免疫試驗。每周免疫1次，共3次。每種抗原肽的劑量為100 μg，注射方式為皮下注射。待預免疫結束后，將小鼠斷頸處死。在無菌的條件下取出小鼠的脾臟，分離出脾臟內的淋巴細胞，使用含10% FBS的RP1640培養基進行培養。

采用CCK-8法測定抗原肽對小鼠淋巴細胞增殖的影響。將上述分離的4組淋巴細胞分別接種到96孔板中，每孔3×105個細胞，之后使用對應的4組抗原肽組合進行刺激。每種刺激物的質量濃度為100 μg/mL，置于37℃，5% CO2的培養箱中培養24 h。待培養時間結束，各孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，放入培養箱中繼續培養4 h，之后使用酶標儀在450 nm處測定各孔的吸光值。

使用酶聯免疫吸附法測定抗原肽對小鼠淋巴細胞釋放干擾素γ的影響。將上述分離的4組淋巴細胞以每孔1.5×105個細胞分別接種到96孔板中，之后分別使用對應的4組抗原肽組合進行刺激。每種刺激物的質量濃度為100 μg/mL，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。待培養結束，將各孔的培養液分別轉移到1.5 mL的離心管中，500×g離心，吸取上清，保存備用。使用Mouse IFN-γ ELISA試劑盒測定上述收集的上清中淋巴細胞釋放IFN-γ的量，按照試劑盒的說明書中詳細的操作步驟進行操作。

使用乳酸脫氫酶法（lactate dehydrogenase，LDH）測定淋巴細胞的細胞殺傷作用。在正常情況下，細胞中的乳酸脫氫酶不會釋放到胞外，而當細胞受損或死亡時，其會在胞外富集，此時該酶的含量就與細胞的死亡數成正比。該試驗采用的靶細胞為小鼠乳腺癌4T1細胞，效應細胞為上述分離得到的淋巴細胞。將靶細胞以每孔1×104個細胞接種到96孔板中，待細胞貼壁后，再分別加入上述分離的4組淋巴細胞，以靶效比（target effect ratio，T∶E ratio）為1∶25和1∶50進行混合，同時設置靶細胞自然釋放孔、淋巴細胞自然釋放孔以及靶細胞最大釋放孔作為對照。將上述96孔板放入37℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。培養結束時，按照乳酸脫氫酶試劑盒中步驟進行操作，最后使用酶標儀在490 nm處測定各孔的吸光值，計算殺傷率。

1.2.4 抗原肽在兩種動物模型上的抑瘤效果

待健康狀況良好的BALB/c小鼠年齡達到5周左右時，分別注射PBS、M1-10、4種抗原肽（HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）、5種抗原肽（M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2），以上4組均與不完全弗氏佐劑混合注射，進行預免疫試驗，每周免疫1次，共3次。每種抗原肽的劑量為100 μg，注射方式為皮下注射。待3次免疫結束，間隔1周后，對免疫后的小鼠皮下接種5×105個4T1乳腺癌細胞，建立移植瘤模型，等腫瘤長到可測量的大小時測量小鼠的體重和腫瘤大小。

待健康狀況良好的MMTV-PyMT原發乳腺癌雌性小鼠2周大時，取其尾尖裂解進行基因型鑒定。其中正向引物為GGAAGCAAGTACTTCACAAGGG，反向引物為 GGAAAGTCACTAGGAGCAGGG。反應體系：正向引物和反向引物各1 μL，模板2 μL，金牌mix酶16 μL。PCR反應條件：98℃預變性5 min；98℃變性15 s；58℃退火20 s；72℃延伸10 s，共32個循環；最后72℃再延伸5 min。PCR反應結束后，將PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察目的條帶。目的條帶大約為500 bp，即鑒定為陽性。

取鑒定為陽性的MMTV-PyMT原發乳腺癌雌性小鼠，待其生長到5周左右開始進行預免疫試驗，免疫方案和之前的一樣。免疫結束后，定期觀察小鼠乳腺部位腫瘤生長的情況，期間做好小鼠體重變化和腫瘤體積變化的記錄。

1.3 數據統計與分析

所有試驗結果均采用Prism軟件進行統計分析。計量資料使用平均值±標準差（±s）表示。試驗得到的數據通過Two-way ANOVA或t檢驗計算得到P值，其統計學顯著差異用星號*表示，其中*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。P＜0.05則認為具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 抗原肽M1-10的預測及分析

已有研究發現［19］，來源于FOXM1蛋白的FOXM1（709～728）肽段能夠顯著抑制腫瘤的生長。于是我們使用該肽段進行了抗原表位預測分析，共得到21種肽段，其中只有5種肽段能夠與HLA-A2分子結合。通過比較這5種肽段與HLA-A2的結合分數，發現肽段FOXM1（719～728），即M1-10（ILLDISFPGL）與HLA-A2分子結合分數最高（圖1a），結合等級也最強（圖1b，分數小于0.5為強結合）。通過分子模擬軟件Chimera 1.15繪制出HLA-A2分子和抗原肽的分子結構，之后通過分子對接軟件和數據處理工具Rosetta分析M1-10與HLA-A2分子的對接情況（圖1c）以及相關的結合參數。此外，本文對應用于臨床I期研究的FOXM1（262～270）也進行了上述的對接分析（圖1d），通過比較M1-10、FOXM1（262～270）與HLA-A2結合的相關參數，發現M1-10與HLA-A2分子的結合更強（表1）。

圖1 抗原肽M1-10的預測與分析Fig. 1 Prediction and analysis of antigenic peptides M1-10（a）抗原肽M1-10的預測分數；（b）抗原肽M1-10與HLA-A2的結合等級；（c）抗原肽M1-10與HLA-A2的結合情況；（d）抗原肽FOXM1（262～270）與HLA-A2的結合情況。SB：強結合；WB：弱結合。(a) The predicted score of antigenic peptide M1-10; (b) The binding grade of antigenic peptide M1-10 to HLA-A2; (c) The binding of antigenic peptide M1-10 to HLA-A2; (d) Antigenic peptide FOXM1 (262～270) binding to HLA-A2. SB: Strong binder; WB: Weak binder.

表1 對接結合的重要參數Tab. 1 Important parameters of docking and combination

2.2 抗原肽的合成與鑒定

為了檢測多肽是否合成成功，我們對所合成的抗原肽進行了質譜分析以及純度檢測（圖2），結果顯示，M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2分別在1086、1084、998、1080、1074處有明顯峰圖。這與各個抗原肽的相對分子質量一致，說明合成成功，并且使用高效液相色譜對合成的抗原肽進行純度檢測，發現五種抗原肽的質量濃度均在90%以上。

圖2 抗原肽的鑒定及純度檢測Fig. 2 Identification and purity detection of antigen peptides（a）M1-10；（b）HJURP；（c）MELK；（d）VEGFR1；（e）VEGFR2。(a) M1-10; (b) HJURP; (c) MELK; (d) VEGFR1; (e) VEGFR2.

2.3 抗原肽M1-10可在小鼠體內誘導有效的免疫記憶

已有研究證實，致敏后的淋巴細胞再次受到同種抗原肽刺激時會發生增殖、分泌細胞因子干擾素γ以及分化為細胞毒性T細胞，從而對靶細胞進行殺傷。因此，為了分析抗原肽M1-10是否能在小鼠體內誘導免疫記憶，我們通過CCK-8試劑盒、Mouse IFN-γ ELISA試劑盒以及乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒，使用各組對應的抗原肽組合，依次對預免疫后小鼠淋巴細胞的增殖情況、干擾素γ的釋放情況以及淋巴細胞的殺傷作用進行了測定。結果發現，單獨使用抗原肽M1-10能顯著促進淋巴細胞的增殖，也可促進淋巴細胞釋放細胞因子干擾素γ，當M1-10與其他4種抗原肽聯用時，其展現的效果更加明顯（圖3a、3b）；此外，抗原肽M1-10也能促進淋巴細胞分化為細胞毒性殺傷T細胞，并對4T1細胞進行殺傷（圖3c）。細胞殺傷試驗顯示，當靶效比為1∶25時，各組的殺傷作用不太明顯，但當靶效比為1∶50時，M1-10與其他4種抗原肽聯用時的殺傷率達到了30%，并且殺傷率可隨著效應細胞的增多而上升。這些結果表明，使用抗原肽M1-10對小鼠進行預免疫，可在小鼠體內形成有效的免疫記憶。

圖3 抗原肽可促進淋巴細胞增殖、釋放干擾素γ以及細胞殺傷作用Fig. 3 Antigenic peptides can promote lymphocyte proliferation, release interferon gamma, and cell killing （a）淋巴細胞增殖；（b）淋巴細胞釋放干擾素γ；（c）淋巴細胞的殺傷作用。(a) Proliferation of lymphocytes; (b) Interferon gamma release by lymphocytes; (c) Killing effects of lymphocytes.

2.4 抗原肽M1-10預免疫可明顯抑制BALB/c荷瘤小鼠腫瘤的生長

試驗分為4組，每組分別使用PBS、M1-10、4種抗原肽（HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）、5種抗原肽（M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2），均與不完全弗氏佐劑混合注射，對5周大的BALB/c小鼠進行預免疫試驗，每周免疫1次，共3次。每種抗原肽的劑量為100 μg，注射方式為皮下注射。待3次免疫結束，間隔1周后，進行皮下植瘤（圖4a），觀察小鼠體重和腫瘤體積的變化。試驗過程中，抗原肽無明顯毒性（圖4b），各試驗組腫瘤體積均小于PBS對照組（圖4c）。試驗終止時，收集各組皮下瘤觀察大?。▓D4d）并稱重（圖4e）。以上結果表明，M1-10抗原肽預免疫能有效抑制腫瘤生長，呈現出良好的抑瘤效果，5種抗原肽聯用時進一步提升了腫瘤的免疫效應。

圖4 抗原肽預免疫在BALB/c荷瘤小鼠模型中抑瘤效果的驗證Fig. 4 Validation of antitumor effects of antigen peptide pre-immunization in BALB/c tumor-bearing mouse model （a）BALB/c小鼠預免疫過程；（b）BALB/c小鼠的體重變化；（c）BALB/c小鼠的腫瘤體積變化；（d）各組小鼠腫瘤的最終大??；（e）各組小鼠腫瘤的質量。(a) Pre-immunization process of BALB/c mice; (b) Body weight change of BALB/c mice; (c) Tumor volume change of BALB/c mice; (d) Final tumor size of mice in each group; (e) The weight of tumor in each group of mice.

2.5 抗原肽M1-10預免疫可明顯抑制MMTVPyMT原發乳腺癌小鼠腫瘤的生長

已有研究證實［20］，經PCR和瓊脂糖凝膠電泳鑒定為陽性的MMTV-PyMT原發乳腺癌小鼠會在乳腺部位自發形成腫瘤（圖5a），因此，我們在第5周分別將PBS、M1-10、4種抗原肽（HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）、5種抗原肽（M1-10、HJURP、MELK、VEGFR1、VEGFR2）與弗氏不完全佐劑混合，對鑒定為陽性的MMTV-PyMT原發乳腺癌小鼠進行皮下免疫，免疫3次后觀察小鼠腫瘤的生長情況。試驗過程中（圖5b），抗原肽無明顯毒性（圖5c）；此外，各抗原肽組與對照組相比呈現出較好的治療效果，其中5種抗原肽混合組的抑瘤效果最好（圖5d）。試驗終止時，收集各組小鼠的腫瘤稱重并對比大?。▓D5e、5f）。這些結果都表明，在MMTV-PyMT原發瘤小鼠模型中，抗原肽M1-10預免疫也能有效抑制腫瘤生長，當M1-10與其他4種抗原肽聯用時進一步提升了腫瘤的免疫效應。

圖5 抗原肽預免疫在MMTV-PyMT原發乳腺癌小鼠模型中抑瘤效果的驗證Fig. 5 Validation of antitumor effect of antigen peptide pre-immunization in MMTV-PyMT primary breast cancer mouse model （a）MMTV-PyMT原發乳腺癌小鼠PCR鑒定結果。1為陽性小鼠基因組，2為陰性小鼠基因組，3和4為試驗鑒定鼠；（b）MMTV-PyMT原發乳腺癌小鼠預免疫過程；（c）MMTV-PyMT原發乳腺癌小鼠體重變化；（d）MMTV-PyMT原發乳腺癌小鼠腫瘤體積變化；（e）每組小鼠腫瘤的質量；（f）各組小鼠腫瘤的最終大小。(a) PCR identification results of MMTV-PyMT primary breast cancer mice. 1 is positive mouse genome, 2 is negative mouse genome, 3 and 4 are experimentally identified mice; (b) Pre-immunization process of MMTV-PyMT primary breast cancer mice; (c) Body weight changes of MMTVPyMT primary breast cancer mice; (d) Tumor volume changes of MMTV-PyMT primary breast cancer mice; (e) Tumor weight of mice in each group; (f) Final tumor size of mice in each group.

3 討論

腫瘤的免疫療法是通過刺激和增強機體免疫功能，從而對腫瘤進行控制和殺傷的。目前主要的免疫療法分為三類，即主動免疫治療（DC疫苗、多肽疫苗等）、被動免疫治療（抗體、效應細胞等）、免疫檢查點治療（PD1、CTLA-4等）。腫瘤多肽疫苗就屬于主動免疫治療，通過腫瘤特異性抗原和相關抗原誘發機體特異性免疫應答。與其他腫瘤疫苗相比，肽疫苗因易合成、安全性良好、能特異性激活免疫細胞等優點已成為研究的熱門［21］。

在本研究中，抗原肽M1-10來源于FOXM1，而FOXM1在多種惡性腫瘤中高表達，在正常組織中低表達或不表達，這意味著FOXM1可能是腫瘤抗原的來源蛋白。本文通過淋巴細胞增殖、干擾素γ釋放及細胞殺傷試驗，證實了抗原肽M1-10可在小鼠體內誘導免疫記憶。在細胞殺傷試驗中，當效靶比為1∶25時，殺傷作用無顯著性差異，可能是由于效應細胞數目不夠，對腫瘤細胞的殺傷力不足；但當效靶比為1∶50時，每組的殺傷作用都明顯上升，說明殺傷作用可隨著效應細胞的數量增加而上升。在兩種小鼠腫瘤模型中，M1-10均顯示出了良好的免疫原性，可被抗原遞呈細胞上的MHC分子識別并結合，之后被T淋巴細胞的TCR受體所捕獲，形成肽-HLA-TCR復合體，誘導淋巴細胞轉化成細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxiclymphocyte，CTL），從而對表達此類抗原的腫瘤進行殺傷。此外，我們還使用M1-10與來源于MELK、HJURP、VEGFR1、VEGFR2的4種抗原肽聯用進行試驗，以誘發更強的免疫應答，結果也與細胞試驗的情況一致，所產生的抑瘤效果比單獨使用抗原肽M1-10要好。

盡管肽疫苗具有較多的優點，也具有較好的臨床效果，但也存在一定的不足。多肽疫苗由于其免疫原性強度有限和體內不穩定性等因素，使得它們易于被蛋白酶體所降解［22］。目前對于多肽的優化有多種策略，如鑒定出多肽發揮功能的特異性位點之后，對該多肽的其他位點進行氨基酸替換，從而優化其水溶解性；此外，可將該線性多肽制備成環狀多肽［23］，又或者將這些混合的抗原肽制備成相應的納米顆粒，進一步提高多肽的免疫原性和穩定性，更好地誘發機體免疫。