近紅外熒光分子探針用于CT成像及術中導航

駱 杰，鐘世根，張 勇，凌智瑜，王志剛

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院超聲科，重慶 400042；2.重慶市人民醫院超聲科，重慶 400014； 3.重慶醫科大學附屬第二醫院心內科，重慶 400010；4.重慶醫科大學超聲分子影像研究所 重慶市重點實驗室，重慶 400010)

精準可視化腫瘤切除術中，定位腫瘤、確定切除邊緣及鑒別微小病灶均為影響預后的重要因素；光學分子影像手術導航技術在其中的應用現已成為研究熱點[1-2]。光學成像技術中，近紅外熒光分子導航以熒光分子為探針進行成像，相比普通光學成像,具有受生物組織影響小、組織穿透性強及信噪比高等優勢[3-4]；但傳統熒光分子探針常依賴腫瘤血管的滯留與滲透效應抵達腫瘤部位，腫瘤富集效率低下，用于增強顯像和術中導航效果欠佳[5]。本研究制備近紅外熒光分子探針，觀察其用于增強CT成像和術中導航的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和設備 主要材料：二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSPE-mPEG2000)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)(西安瑞禧生物技術公司)；膽固醇、IR780、吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)、全氟溴辛烷(perfluorooctyl bromide, PFOB)(美國Sigma)；DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚，DAPI)(上海碧云天生物技術公司)。主要設備：旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；聲振儀(Heat System Inc)，馬爾文粒徑儀(美國Zetasize)；光學顯微鏡(日本Olympus)；透射電鏡(H7500)；UV-2500紫外分光光度計(日本島津)；激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon)；BD FACS Vantage 流式細胞儀；CT儀(GE)；活體熒光成像系統(美國PerkinElmer)；實時近紅外熒光成像系統(日本Nikon)。

1.2 制備IR780@LIP-PFOB 按12:5:3質量比分別稱取DPPC、DSPE-mPEG2000、膽固醇共20 mg置于圓底燒瓶，加入1 mg IR780，以5 ml CHCl3充分溶解，置于旋轉蒸發儀，于50℃下旋轉蒸發至形成一層綠色薄膜；在超聲波作用下以4 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)水化，直至綠色薄膜全部脫落，并移至10 ml EP管內；加入200 μl PFOB，以100 W聲振儀處理2 min，離心后收集沉淀物，得到IR780@LIP-PFOB。重復上述制備過程，不加IR780，得到空白脂質體(LIP-PFOB)；不加IR780，蒸發結束后以含1 mg ICG的PBS水化，其余步驟同前，制得載ICG的脂質體(ICG@LIP-PFOB)。

1.3 構建4T1荷瘤鼠模型 健康雌性BALB/c小鼠26只(購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；動物許可證編號：430727220100738472)，4～6周齡，18～22 g。于背部皮下接種1×106處于對數生長期的4T1細胞(上海中喬新舟生物科技有限公司)，待腫瘤長至100 mm3備用，造模成功21只。遵循實驗動物倫理進行所有動物實驗。

1.4 檢測IR780@LIP-PFOB表征 以數碼相機拍攝LIP-PFOB和IR780@LIP-PFOB重懸液；在光學顯微鏡、透射電鏡下觀察IR780@LIP-PFOB形態、結構，以馬爾文粒徑儀檢測其粒徑大小和表面電位。以紫外分光光度計檢測IR780、LIP-PFOB與IR780@LIP-PFOB吸收光譜，繪制IR780標準曲線，并計算IR780包封率。

1.5 CT成像 采集水與不同濃度IR780@LIP-PFOB(1、2、3、4、5 mg/ml)的CT圖像，參數：管電流160 mA，管電壓80 kV。對3只荷瘤鼠經尾靜脈注射200 μl IR780@LIP-PFOB(5 mg/ml)，24 h后行CT成像及定量分析。

1.6 4T1細胞IR780@LIP-PFOB攝取率 取對數生長期4T1細胞(1×105)接種于共聚焦培養皿中繼續培養12 h，之后分別加入200 μl 0.1 mg/ml DiI標記的LIP-PFOB和IR780@ LIP-PFOB，共孵育1 h。以激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞對LIP-PFOB與IR780@LIP-PFOB的攝取。

1.7 體內IR780@LIP-PFOB分布 對3只荷瘤，經尾靜脈注射IR780@LIP-PFOB(5 mg/ml，200 μl)，采用小動物活體熒光成像儀采集注射24 h后的熒光圖，以熒光成像系統測量腫瘤區域注射前、后熒光強度值。處死荷瘤鼠，對心、肝、脾、肺及腎等臟器和腫瘤組織進行離體熒光成像，對比注射前后腫瘤區域熒光強度變化。

1.8 術中導航 取9只荷瘤鼠隨機均分為3組，各經尾靜脈注射IR780@LIP-PFOB(5 mg/ml，200 μl)、注射等劑量ICG@LIP-PFOB或無干預。24 h后麻醉動物，行模擬手術，切開腫瘤表面皮膚、充分暴露腫瘤區域并留取照片，再以實時熒光成像系統觀察腫瘤組織并拍攝圖像與之前比較，并進行定量分析。

1.9 腫瘤區IR780@LIP-PFOB分布 取6只荷瘤鼠隨機均分為2組，分別經尾靜脈注射DiI標記的IR780@LIP-PFOB或LIP-PFOB(5 mg/ml，200 μl)；24 h后處死荷瘤鼠，剝離瘤塊，以冰凍切片對比觀察腫瘤內2種脂質體的聚集。剝離腫瘤組織與周圍非瘤組織，行冰凍切片，經DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察細胞核。

1.10 安全性評價 另取6只健康雌性BALB/c小鼠，4～6周齡，18～22 g，隨機均分為2組，經尾靜脈注射200 μl IR780@LIP-PFOB(5 mg/ml)或無干預；7天后取血清分析肝、腎功能。

2 結果

2.1 表征 肉眼觀察，制備的IR780@LIP-PFOB為綠色懸濁乳液， LIP-PFOB呈白色乳糜樣(圖1A)；IR780@LIP-PFOB光鏡下呈大小均勻的圓粒(圖1B)，透射電鏡下為球形結構，粒徑約250 nm(圖1C)，其平均粒徑為(262.80±117.60)nm(圖1D)，表面電位為(-20.10 ±6.38)mV(圖1E)。IR780@LIP-PFOB在790 nm出現波峰，與單獨IR780的峰值接近；LIP-PFOB在紫外可見光區域無最大吸收峰(圖1F)。

2.2 CT成像 體外CT成像顯示，CT信號隨IR780@LIP-PFOB濃度增高而加強，見圖2A、2B。體內CT成像顯示，注射IR780@LIP-PFOB 24 h后腫瘤區CT值較注射前明顯增高(P<0.05)，見圖2C、2D。

2.3 細胞攝取 4T1細胞與IR780@LIP-PFOB共同孵育后，其周圍可見大量紅色熒光；而以LIP-PFOB處理后未見確切紅色熒光。4T1細胞對IR780@LIP-PFOB的攝取率為98.96%，對LIP-PFOB的攝取率為7.91%。見圖3。

2.4 IR780@LIP-PFOB體內分布和術中導航 注射IR780@LIP-PFOB 24 h后可于荷瘤鼠腫瘤區探及橙色熒光(圖4A)。離體熒光成像顯示腫瘤熒光信號強于其他臟器組織(圖4B)，與注射前相比，腫瘤區熒光信號值明顯增強(P<0.05，圖4C)。術中導航時，注射IR780@LIP-PFOB前腫瘤區無熒光信號，注射后腫瘤區可見較強熒光信號，且邊界清晰(圖4D)；注射前腫瘤與周圍非瘤組織熒光強度比值為1.06±0.11，注射后為2.93±0.35(圖4E)，差異有統計學意義(P<0.001)。注射ICG@LIP-PFOB后腫瘤區僅見弱熒光，與非瘤組織分界不清。

2.5 腫瘤內 IR780@LIP-PFOB分布 注射IR780@LIP-PFOB后，腫瘤周圍見大量紅色熒光富集(圖5A)，而注射LIP-PFOB后腫瘤內僅見微弱紅色熒光(圖5B)。

2.6 安全性評價 對BALB/c鼠經尾靜脈注射IR780@LIP-PFOB7天后，其肝腎功能未發生明顯改變，見圖6。

圖1 IR780@LIP-PFOB表征 A.IR780@LIP-PFOB和LIP-PFOB懸液外觀； B.IR780@LIP-PFOB光鏡圖； C.IR780@LIP-PFOB電鏡圖； D.IR780@LIP-PFOB粒徑分布圖； E.IR780@LIP-PFOB表面電位分布圖； F.LIP-PFOB、IR780與IR780@LIP-PFOB紫外吸收光譜圖

圖2 體內外CT成像 A.水及不同濃度IR780@LIP-PFOB體外CT成像圖； B.不同濃度IR780@LIP-PFOB的體外CT值線性關系圖； C、D.BALB/c荷瘤鼠模型注射IR780@LIP-PFOB前及注射24 h后腫瘤區CT圖及CT值

圖3 4T1細胞攝取LIP-PFOB、IR780@LIP-PFO A.激光共聚焦顯微鏡圖； B.流式細胞儀檢測圖

圖4 IR780@LIP-PFOB體內分布和術中導航所見 A.注射IR780@LIP-PFOB 24 h后4T1荷瘤鼠活體熒光成像圖； B.IR780@LIP-PFOB在各離體臟器和腫瘤內的分布； C.注射IR780@LIP-PFOB前與注射24 h后腫瘤區熒光信號值；D.注射IR780@LIP-PFOB、ICG@LIP-PFOB前及注射24 h后腫瘤區照片及術中實時近紅外熒光成像； E.注射前與注射24 h后腫瘤熒光信號值與背景信號值比

3 討論

傳統上，醫學影像學主要可對腫瘤進行術前評估和術后監測，而在術中判斷腫瘤部位和邊界則主要依賴術者進行視診和觸診，缺乏客觀評價。術中導航有助于定位腫瘤、確定于邊界而實現精準切除，減少術后并發癥，提高患者術后生存率[6]。隨著分子影像學、尤其光學成像技術的發展，已可在外科手術中連續、實時、動態監測病灶部位，且與其他成像模式相比靈敏度極高[7]。為進一步將高靈敏度的分子熒光成像技術用于術中導航等，需要引入同時具有高信噪比、高分辨率且能于腫瘤部位高效富集的熒光分子探針。ICG為目前臨床常用熒光探針，以廣泛用于探測乳腺癌前哨淋巴結及肝癌、胃腸道腫瘤和皮膚癌等術中導航[8-9]；但ICG只能通過被動靶向到達腫瘤部位，富集效率較低，輔助定位腫瘤作用有限。

IR780是一種近紅外熒光染料，可在不添加其他配體的情況下通過糖酵解、細胞膜電位及有機陰離子轉運肽等介導而被腫瘤細胞高攝取，進而在腫瘤部位高效富集[10-11]。CT密度分辨力高，組織結構影像無重疊[12]。本研究設計并制備的裝載IR780和PFOB的近紅外熒光分子探針近紅外熒光性能良好，且可選擇性聚集于腫瘤區域。PFOB可充當CT對比劑，改善脂質體結構[13]；由此構建的脂質體也可作為新型CT分子探針，獲取更豐富的影像學資料。

圖5 病理圖示腫瘤內IR780@LIP-PFOB分布 A.冰凍切片圖示腫瘤區域LIP-PFOB與IR780@LIP-PFOB分布； B.熒光顯微鏡圖示IR780@LIP-PFOB在腫瘤與周圍非瘤組織內的分布(藍色為細胞核，紅色為DiI-IR780@LIP-PFOB)

圖6 BALB/c鼠經尾靜脈注射IR780@LIP-PFOB后7天其肝腎功能

本研究將IR780裝載于磷脂雙分子層中，以提高其光穩定性、增加其生物相容性。肉眼觀IR780@LIP-PFOB呈綠色懸濁乳液，而LIP-PFOB呈白色乳糜樣。該探針形態規則，大小均一，分散性好，粒徑分布呈正態分布。體外CT成像結果顯示， IR780@LIP-PFOB可顯著增強CT成像，并呈濃度依賴性；體內結果證實其可有效到達腫瘤區域而用于腫瘤CT成像。

IR780@LIP-PFOB聚集于腫瘤區域是將其用于術中導航的前提和基礎。在不連接配體的情況下，傳統熒光顯影劑只能通過被動靶向(腫瘤血管的滯留與滲透效應)到達腫瘤組織，富集效果較差。本研究制備的IR780@LIP-PFOB可在腫瘤區域富集，而在周圍非瘤組織中聚集較少，通過檢測IR780@LIP-PFOB的分布，可明確腫瘤邊界，為術中導航奠定基礎。體視熒光顯微鏡結果顯示，注射IR780@LIP-PFOB 24 h后，腫瘤區域在紅外成像系統下清晰可見，且邊界清楚；冰凍切片結果顯示，大量IR780@LIP-PFOB富集于腫瘤組織，而周圍非瘤組織較少聚集，其間分界明顯；且注射后7天小鼠肝、腎功未見明顯改變，初步證實了此探針的安全性。

總之，本研究成功制備的IR780@LIP-PFOB可增強CT成像效果并能用于術中導航。但本研究僅針對鼠源性乳腺癌，所獲分子探針能否選擇性聚集于其他腫瘤并用于CT成像和術中導航有待后續進一步觀察。