稗草生防菌NX2A的鑒定、安全性及對稗草的致病條件

鐘加日　劉璐　曾穎　朱哲遠　柏連陽　彭迪

摘要：【目的】明確分離自感病稗草葉片的菌株NX2A的分類學屬性、對農田常見作物的安全性及對稗草的致病條件，為菌株NX2A的田間應用提供理論依據。【方法】結合形態學觀察和ITS序列分析確定菌株NX2A的分類學屬性;通過作物安全性評價明確菌株NX2A對農田常見作物水稻、油菜、辣椒、番茄和茄的安全性;選用L₉（3⁴）正交表，以濕度、稗草葉齡、光照時間和孢子濃度為考察因素，以病情指數和鮮重防效為考察指標，進行菌株NX2A致病條件試驗。【結果】結合菌株NX2A的形態學鑒定和分子生物學鑒定結果，將菌株NX2A鑒定為新月彎孢菌（Curvularia lunata）;作物安全性評估試驗結果表明，菌株NX2A孢子懸浮液對水稻、油菜、辣椒、番茄和茄的生長無明顯影響，植株葉片未見與稗草相同或類似的病斑;菌株NX2A對稗草的致病條件測定結果表明，各因素影響菌株NX2A對稗草病情指數的順序為光照時間>孢子濃度>濕度>稗草葉齡，影響菌株NX2A對稗草鮮重抑制率的順序為孢子濃度>光照時間>濕度> 稗草葉齡。菌株NX2A防控稗草的最優組合為A₃B₁C₃D₂，即以濃度為5.0×10⁶個/mL的孢子懸浮液噴施于1葉期稗草，12 h光照、85%濕度保濕培養。【結論】新月彎孢菌菌株NX2A對稗草有較好的防控效果，且對水稻、油菜、辣椒、茄和番茄等作物安全，具有作為水田稗草生物防控的潛力。

關鍵詞： 稗草;新月彎孢菌;安全性;致病條件

中圖分類號： S451.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）02-0469-08

The identification， safety， and efficacy of the biocontrol fungi NX2A for Echinochloa crusgalli

ZHONG Jia-ri LIU Lu ZENG Ying ZHU Zhe-yuan BAI Lian-yang PENG Di

（1College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha? 410128， China; 2Biotechnology Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha? 410125， China; 3Anxiang County Plant

Protection Station of Hunan Province， Changde， Hunan? 415600， China）

Abstract：【Objective】The strain NX2A was isolated from the leaves of susceptible Echinochloa? crusgalli. Its taxonomic properties， safety for common farm crops， and pathogenic conditions for barnyard grass were studied? to provide a theoretical basis for biological control of E. crusgalli. 【Method】The strain was identified by morphological charaterization combined with ITS sequence analysis. The safety of NX2A on common crops like rice， rape， pepper， tomato and eggplant was determined via safety evaluation. L9（34） orthogonal experiment was used in the pathogenicity experiment of NX2A. Humidity， leaf stage， light and inoculation concentration was chosen as factors，? disease index and? the inhibition rate of fresh weight were as evaluation indexes. 【Result】The pathogenic strain NX2A was identified as Curvularia lunata according to morphological identification and molecular identification. The spore suspension of NX2A had no obvious effects on rice， rape， pepper， eggplant and tomato. Plant leaves did not show the same or similar disease spots as barnyard grass. The results of pathogenicity experiment showed that the degree of the influence on disease index were in the order：light > inoculation concentration > humidity > leaf stage; the degree of the influence on fresh weight were in the order：inoculation concentration > light > humidity > leaf stage. The optimum treatment was A3B1C3D2， namely， 85% humidity， the 1-leaf stage， 12 h light， inoculation concentration was 5.0×106 spores /mL. 【Conclusion】C. lunata strain NX2A has a good prevention and control effect on barnyard grass， and is safe for rice， rape， pepper， eggplant， tomato， and has the potential of biological prevention and control of barnyard grass in paddy field.

Key words： Echinochloa crusgalli; Curvularia lunata; safety; pathogenicity conditions

Foundation items：National Modern Agricultural Industrial Technology System（CARS-16-E19）; The Key Laboratory Project of Weed Biology and Safety Prevention and Control in Hunan （2015TP1016）

0 引言

【研究意義】水稻是我國三大主要糧食作物之一，其產量與我國及世界的糧食安全息息相關（趙凌等，2015）。稗草（Echinochloa crusgalli）是一種一年生草本植物，其生長勢、繁殖速度及競爭水分等能力強于水稻，且是部分水稻病害的中間宿主，致使水稻大幅減產，嚴重時甚至絕收（佟瑤等，2021）。防控稗草的方法有物理防治、化學防治和生物防治。目前化學除草劑因便捷有效、低成本等優點，已成為稗草防控的主要措施，但長期、大量及不合理使用，造成農藥殘留、生物多樣性降低等生態問題，且化學除草劑作用靶標位點單一，稗草對化學除草劑已產生不同程度的抗性（劉興林等，2015;左平春等，2017;李香菊，2018）。馬國蘭等（2021）的研究結果表明，在長江中下游地區7省70個稗草田間種群均對五氟磺草胺產生了不同程度的抗藥性，高水平抗性種群達50.7%。鑒于物理防治稗草的效率低下，以及化學除草劑帶來的生態及抗藥性等問題，迫切需要開展稗草生防菌研究工作，為生產上防治稗草提供科學依據。【前人研究進展】利用控草微生物防除雜草是未來雜草防控的重要途徑和發展方向。控草微生物中利用最多的是控草真菌，國內外在控草真菌的新菌株篩選及商品化等方面進行了大量研究，有20個以上微生物除草劑得到應用（陳世國和強勝，2015;朱海霞和馬永強，2020）。微生物除草劑具有降解性好、安全性高、對環境污染小等優點，大力推廣使用微生物除草劑對發展環境友好型的生態農業具有重要意義（張紅梅等，2021）。但微生物除草劑的使用常受到田間環境的影響，從而出現田間雜草防效不穩定等現象，致使微生物除草劑在雜草防除中占比較低（陳世國和強勝，2015）。因此，探索影響控草微生物對雜草防效的主要因素，對微生物除草劑的成功應用以及對雜草的防控起到關鍵作用。對此已有學者開展了一系列研究。韋韜等（2011）通過單因素法表明接種時稗草葉齡、接種后保濕時間、接種濃度是生防菌新月彎孢菌（Culvularia lunata）菌株J15（2）對稗草防效的影響因素;Li等（2013）采用單因素法表明接種時稗草葉齡、接種后保濕時間、接種濃度是新月彎孢菌菌株B6對稗草防效的影響因素;李健等（2016）以單因素法確定濕度是ZC201301對馬唐防效的影響因素。然而多數研究者使用單因素法來考慮防控影響因素，選擇出的最佳試驗條件只是依靠單因素最佳條件的集合，缺乏對在田間整體環境影響的綜合性研究。【本研究切入點】菌株NX2A是本課題組前期從感病稗草葉片上分離獲得的一株稗草致病菌，但尚未對其分類學屬性及對農田常見作物的安全性和對稗草的致病條件開展研究。【擬解決的關鍵問題】綜合形態學觀察和ITS序列分析確定菌株NX2A的分類學地位;通過作物安全性評價明確菌株NX2A對農田常見作物的安全性;選用L₉（3⁴）正交表，以濕度、稗草葉齡、光照時間和孢子濃度為考察因素，以病情指數和鮮重抑制率為考察指標，進行菌株NX2A致病條件試驗，獲得菌株NX2A對稗草防效的主要影響因子及理論最優組合，綜合考察菌株NX2A在復雜環境中對稗草的防效，以期為控草微生物的田間應用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試菌株：菌株NX2A，由湖南省農業科學院生物技術研究所微生物學研究室提供，于2018年分離自感病稗草葉片。供試植物：稗草、水稻（Oryza satiua）、油菜（Brassica napus）、辣椒（Capsicum annuum）、番茄（Solanumly copersicum）、茄（Solanum melongena）。培養基：馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15～20 g，去離子1 L，pH 7.0）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 孢子懸浮液制備 將菌株NX2A接種于PDA培養基，28 ℃下黑暗培養14 d，用0.05%吐溫80無菌水溶液刮洗培養基表面菌體，將孢子懸浮液置于已滅菌三角瓶內，充分振蕩后用已滅菌的脫脂棉進行過濾，再以血球計數板計數，確定孢子懸浮液濃度。

1. 2. 2 菌株NX2A鑒定 形態鑒定：將菌株NX2A接種于PDA培養基，28 ℃下黑暗培養10 d，期間觀察并記錄菌落形態。使用0.05%吐溫80無菌水溶液刮洗培養基表面菌體，使孢子脫落，制成孢子懸浮液，于顯微鏡下觀察菌株NX2A的分生孢子形態，結合《真菌鑒定手冊》（魏景超等，1979）對菌株NX2A進行形態鑒定。

分子生物學鑒定：用CTAB法提取菌株NX2A的全基因組DNA（張穎慧等，2008），以引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3'）進行rDNA-ITS特異性擴增，PCR反應體系40.0 μL：2×Taq PCR MasterMix Ⅱ 20.0 μL（天根生化有限公司），DNA模板2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加ddH₂O補足至40.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸5 min。反應結束后，取2.5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在UNITE 4.0數據庫中進行massBLASTer比對分析（Nilsson et al.，2019），根據比對結果使用MEGA-X10.2.1的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹。

1. 2. 3 菌株NX2A對農作物的安全性評估 將濃度為5×106個/mL的孢子懸浮液噴施于2葉期水稻、油菜、辣椒、茄和番茄植株上，28 ℃下12 h光照保濕24 h后，轉入溫室繼續培養，以噴施0.05%吐溫80為陰性對照，以相同濃度孢子懸浮液噴施于2葉期稗草植株為陽性對照，試驗設3個重復。接種10 d后，觀察植株發病情況。葉片發病程度分級標準：0級，葉片無任何病斑;1級，葉片上有病斑零星分布;2級，1/3～2/3葉片爛死;3級，2/3以上葉片爛死;4級，葉片全部爛死（李永龍，2013）。

1. 2. 4 菌株NX2A對稗草的致病條件測定 以濕度、稗草葉齡、光照時間和孢子濃度為因素，每因素3個水平，設計4因素3水平9處理的正交試驗（表1）。以處理對應濃度孢子懸浮液噴施于相應葉期的稗草植株上，相應光照時間、相應濕度在28 ℃恒溫箱24 h后轉入溫室培養。以噴施0.05%吐溫80為空白對照，試驗重復3次。接種10 d后調查稗草發病情況，按公式1計算病情指數。收集稗草地上部分，按公式2計算鮮重抑制率。

病情指數（%）=[Σ（病級葉片數×對應級別數）/調查葉片總數×最高級別數]×100 （1）

鮮重抑制率（%）=（對照鮮重-處理鮮重）/對照鮮重×100 （2）

1. 3 統計分析

試驗數據采用DPS 9.01進行統計分析，用顯著差數法（LSD）進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2. 1 菌株鑒定結果

2. 1. 1 形態學鑒定 菌株NX2A在PDA培養基上的菌落呈圓形，邊緣規則，為黑棕色（圖1-A）。分生孢子褐色，具有3個顏色較深的隔膜，自基部數至第3個細胞膨大，并使孢子呈彎曲狀（圖1-B）。通過形態學初步鑒定菌株NX2A為彎孢屬（Curvularia sp.）。

2. 1. 2 分子生物學鑒定 利用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測（圖2），測序獲得605 bp的片段（GenBank登錄號為OK085709），通過構建系統發育進化樹發現，菌株NX2A序列與C. lunata strain D25B和C. lunata strain 6-4F聚在一支，支持率為89%，遺傳距離最近（圖3）。結合形態學鑒定和分子生物學鑒定結果，將菌株NX2A鑒定為新月彎孢菌（C. lunata）。

2. 2 菌株NX2A對農作物的安全性評估

將濃度為5×10⁶個/mL的菌株NX2A孢子懸浮液噴施于2葉期稗草，接種3 d后，稗草葉片上產生黑色病斑，圓形或不規則形，病斑逐漸增多并相互匯合成不規則形的大黃褐色病斑（圖4-A）;接種10 d后，稗草葉片1/3以上甚至全部爛死，葉片發病程度2級或3級，甚至4級，且稗草的生長受到明顯抑制（圖4-B）。

將濃度為5×10⁶個/mL的菌株NX2A孢子懸浮液噴施于2葉期作物，10 d后，水稻、油菜、番茄、辣椒和茄植株上未見與稗草相同或類似的病斑，病情指數為0，且對作物植株的后續生長無不良影響（圖5-A～圖5-E）。表明菌株NX2A對水稻、油菜、番茄、辣椒和茄5種常見作物安全，對稗草具有強致病性。

2. 3 菌株NX2A對稗草的致病條件

經菌株NX2A孢子懸浮液噴施處理后，稗草生物量、株高均受到明顯抑制，表現出不同程度的致病性（表2）。病情指數介于17.69%～86.51%，鮮重抑制率介于-2.15%～69.64%，其中，在濃度為5.0×106個/mL的孢子懸浮液噴施于1葉期稗草，12 h光照、85%濕度保濕條件下，菌株NX2A對稗草的病情指數和鮮重抑制率最高，分別為86.51%和69.64%。

從表3可看出，各因素對菌株NX2A在稗草上的病情指數影響順序為：光照時間（C）>孢子濃度（D）>濕度（A）>稗草葉齡（B），且增加濕度有利于菌株NX2A對稗草的侵染;各因素影響菌株NX2A對稗草鮮重抑制率的順序為孢子濃度（D）>光照時間（C）>濕度（A）>稗草葉齡（B），且增加濕度可提高菌株NX2A對稗草鮮重的抑制效果，菌株NX2A對1葉期稗草的鮮重抑制效果最佳。

從表4分析結果可知，濕度、光照時間和孢子濃度對病情指數有極顯著影響（P<0.01），稗草葉齡對病情指數影響不顯著（P>0.05），以菌株NX2A對稗草的侵染為目標，可將致病條件確定為A₃B₂C₃D₂，即以濃度為5.0×10⁶個/mL的孢子懸浮液噴施于2葉期稗草，12 h光照、85%濕度保濕;濕度、稗草葉齡、光照時間和孢子濃度對稗草鮮重抑制率有極顯著影響，以菌株NX2A對稗草鮮重的防控（鮮重抑制率）為目標，可將致病條件確定為A₃B₁C₃D₂，即以濃度為5.0×10⁶個/mL的孢子懸浮液噴施于1葉期稗草，12 h光照、85%濕度保濕。

3 討論

自然界中的植物致病微生物是微生物除草劑的重要來源，新月彎孢菌是被發掘利用較多的一類植物病原真菌，但部分新月彎孢菌也會對作物產生不利影響。據文獻報道，南方地區主要水田作物水稻和蔬菜作物辣椒等均能被新月彎孢菌侵染，導致作物的產量和品質下降（費丹等，2014;斐月令等，2021）。劉麟等（2021）從北方向日葵上分離出一株致病的新月彎孢菌;鄭金龍等（2021）鑒定出鈍葉草葉斑病的病原菌為新月彎孢菌;AbdElfatah等（2021）發現一株新月彎孢菌是埃及番茄早疫病的新病原菌。因此，評估菌株對作物的安全性，是菌株制成生物除草劑的首要前提。檢測菌株對作物的安全性，一般是將菌株孢子懸浮液噴霧接種于作物幼苗植株上，若作物植株上未出現與目標雜草一致或類似病斑，且作物植株生長狀態良好，則說明菌株對該作物安全。本研究通過選擇主要水田及其周圍主要旱地作物進行安全性評價，將菌株NX2A分生孢子懸浮液噴施于2葉期水稻、油菜、辣椒、茄和番茄5種作物后，均未出現與稗草相同或類似的病斑，作物生長狀態良好。研究表明新月彎孢菌的致病性與其遺傳背景具有相關性（張欣芳等，2010），不同遺傳背景的新月彎孢菌具有不同的致病力及寄主范圍。因此，由感病稗草葉片上分離獲得的菌株NX2A具有對水稻安全、對稗草具有強致病性的可能性。Li等（2013）從感病稗草上分離獲得的新月彎孢菌B6對水稻安全，且對稗草具有強致病性。陸俞萍等（2021）自茶園感病雜草上分離得到的新月彎孢菌菌株ZJJMT-1-7為茶園雜草的病原菌。張亞鑫等（2021）從感病稗草上分離得到的新月彎孢菌菌株JSLS-3-4為田間稗草的病原菌。綜合菌株NX2A的遺傳背景及作物安全性試驗，初步表明施用菌株NX2A的區域農作物可安全生長。

確定生防菌對目標雜草具有良好的防治效果，明確各因素對生防菌防效的影響，是開發生物除草劑的重要前提（李永龍，2013）。本研究以稗草的病情指數和鮮重抑制率為考察指標，以濕度、稗草葉齡、光照時間和孢子濃度為考察因素，進行菌株NX2A致病條件試驗，結果表明，菌株NX2A對稗草的最佳防效組合為：孢子濃度5.0×10⁶個/mL，1葉期稗草，12 h光照，85%濕度保濕培養，在該條件下，稗草的病情指數可達86.51%、鮮重抑制率可達69.64%。

正交試驗是基于數理統計原理，綜合多因素，尋找主要影響因子以及最優水平組合的試驗設計方法，具有高效、方便、全面的特點（陳小樺等，2012;王玄靜，2016）。一般從以下幾個方面進行分析：（1）R值越大，對考察指標的影響越大;（2）K值最大的為最佳水平;（3）P值小于0.05，因子對指標具有顯著影響;（4）綜合各因子的最佳水平以及對考察指標具有顯著影響，初步獲得試驗的理論最優水平組合。與新月彎孢菌菌株J15（2）（韋韜等，2011）和B6（Li et al.，2013）的防效與稗草葉齡呈負相關不同，菌株NX2A在1～3葉期稗草的病情指數無顯著差異，表明菌株NX2A對稗草的致病周期更長、更有利于施用。較不夠全面的單因子法而言，本研究采用的正交試驗更為全面，在確定菌株NX2A對稗草防效的顯著影響因子時，可獲得菌株NX2A對稗草防效的主要影響因子以及理論最優組合。

4 結論

新月彎孢菌菌株NX2A對稗草有較好的防控效果，且對水稻、油菜、辣椒、茄和番茄等作物安全，具有作為水田稗草生物防控菌劑的潛力。影響菌株NX2A侵染稗草幼苗的主要因素是孢子濃度和光照時間，應著重考慮這2個因素對菌株NX2A防控稗草效果的影響。

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（責任編輯 麻小燕）