谷子秸稈雨水淋溶物對其根圍土壤細菌多樣性的化感效應

馮茹姬 胡春艷 董淑琦 楊雪芳 郭振宇 原向陽 胡桃花 郭平毅

(1.山西農業大學 植物保護學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801；3.山西省晉中市氣象局，山西 晉中 030600)

化感作用指活體植物、微生物向環境中釋放的某種化學物質，對其他生物或自身生長發育產生的直接或間接的促進或者抑制作用[1]?；行嬖谟谠S多根系分泌物和植物殘體腐解物中[2]。雨霧淋溶、自然揮發、根分泌和植株分解是植物化感物質釋放到環境中的4種途徑。從植株殘體中得到的降水淋溶液可以顯著抑制其他植物生長[3-4]，利用植物殘體覆蓋耕地能夠有效地控制雜草[5]，都說明植株殘體淋溶是化感物質釋放的途徑之一。

土壤微生物能反映土壤肥力和質量變化以及環境質量狀況，其種群數量關系到有機質的分解和礦質元素的轉化，影響作物的吸收和利用[6]。秸稈還田是秸稈綜合利用最有效和最主要的途徑，還田方式分為直接還田和間接還田[7]。不同秸稈還田方式對土壤理化性狀的影響效果不同，對土壤微生物產生的影響不同：一方面秸稈還田通過影響土壤結構、土壤微氣候(土壤水分、土壤溫度等)和土壤養分，可顯著影響土壤微生物群落結構和多樣性[8-12]；另一方面秸稈還田為微生物提供豐富的能量和碳源，提高微生物的生物活性，為促進土壤有機質的分解和礦質元素的轉化提供有力保障，如此往復形成良性的循環鏈，進而對后期作物健康生長及豐產有著積極的推動作用[13-17]。Li等[18]研究發現秸稈還田配施混合控釋氮肥增加了參與纖維素和木質素降解的假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和腐質霉屬等細菌的豐度，加速了小麥灌漿期土壤的礦化和腐殖化過程，在實現作物增產的同時循環利用作物秸稈。張翰林等[19]研究發現秸稈還田處理提升了稻麥輪作土壤真菌群落多樣性，但對細菌群落多樣性無顯著影響。韋安培[20]研究表明，秸稈還田顯著改善了土壤理化性質，顯著提高土壤微生物碳源代謝能力和代謝活性，最終顯著增加了小麥產量。另外，周東興等[21]研究發現，隨著秸稈還田量的增加，秸稈腐解微生物群落碳源代謝活性、豐富度指數、優勢度指數和均勻度指數均表現出先增加后降低的趨勢。但是李濤等[22]的研究表明秸稈施入雖然提高了土壤微生物群落的生理代謝活性，但對微生物功能多樣性指數沒有顯著性影響。近年來，對秸稈還田條件下土壤微生物進行的一些相關研究，主要集中在水稻、小麥和玉米等作物上[23-27]，對谷子的研究相對較少。因此，為了解秸稈覆蓋化感物質對根圍土壤細菌群落多樣性的影響，本研究擬采用隨機區組設計，在谷子株高達到20 cm后于壟間覆蓋不同質量和長度的秸稈，灌漿期中雨后5 d采集根圍土壤，利用16S rRNA擴增子測序技術，分析谷子秸稈雨水淋溶物對其根圍土壤的細菌種群豐度和多樣性的化感效應，以期為合理的秸稈覆蓋還田技術推廣應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于山西農業大學農作站(37°25′ N，112°34′ E)，海拔799.6 m。屬于暖溫帶大陸性氣候，年均日照時間為2 500～2 600 h，一年的有效積溫約3 500～3 600 ℃，平均年降水量462.90 mm，每年的降水主要集中在7、8和9月。試驗土壤類型為沙壤土，播前表層土壤各養分含量為：有機質8.52 g/kg，全氮1.22 g/kg，全磷0.76 g/kg，全鉀19.36 g/kg，硝態氮64.20 mg/kg，有效磷43.70 mg/kg，速效鉀484.20 mg/kg，pH 8.21。

1.2 試驗設計

試驗于2019年5月—10月在山西農業大學農作站試驗田進行。試驗品種為晉谷21號(山西省農科院經濟作物研究所選育)，于2019年5月播種，播前撒施復合肥750 kg/hm2作為基肥，谷子生長期間不施肥，進行常規田間管理。在谷子出苗20 cm時，將供試秸稈均勻覆蓋在對應區域行間。試驗采用隨機區組設計，設不同秸稈質量和不同秸稈長度2個因素，以不覆蓋秸稈為對照，共7個處理組合，每處理重復3次，每小區面積為20 m2(4 m×5 m)。試驗區組設計見表1。

表1 試驗地秸稈覆蓋方案Table 1 Straw mulching scheme of experimental

土樣采集：于2019年谷子灌漿期中雨后5 d采用五點取樣法采集0～5 cm谷子根圍表層土壤，每小區重復3次，去除谷子根系、植株殘體和石子等雜物，過1 mm土壤分樣篩后混合均勻，放入冰盒帶回實驗室，保存至-80 ℃冰箱用于DNA提取等分子生物學分析。

1.3 試驗方法

1.3.1DNA 抽提

土壤總DNA抽提使用E.Z.N.A.?soil試劑盒，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2 000進行檢測，DNA提取質量利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓5 V/cm，時間20 min。

1.3.2PCR擴增

用特異性引物515F (5′-GTGYCAGCMGCC-GCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′)對細菌16S V4可變區進行PCR擴增。PCR擴增程序為：95 ℃預變性3 min，35個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min。擴增反應體系為20 μL。

1.3.3PCR產物鑒定、純化及定量

每個樣本3個PCR重復，將3個重復的PCR產物混合，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行PCR產物純化，Tris-HCl洗脫后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，再采用QuantusTMFluorometer對其進行檢測定量。按照測序量要求，進行相應比例的混合后進行細菌多樣性測定。

1.3.4高通量測序數據的分析

根據參考文獻[28]、[29]和[30]的方法將測序序列結果進行質控后得到有效數據。利用Uparse軟件、SILVA132的SSUrRNA數據庫進行OTUs聚類和物種注釋分析。以樣本中數據量最少的為標準進行均一化處理，進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Chao1、Shannon、Simpson、ACE指數；使用Origin 2021繪制稀釋曲線；使用R軟件(Version 2.15.3)通過wilcox秩和檢驗分析Alpha多樣性指數差異性；使用R軟件的vegan軟件包進行NMDS分析。

利用PICRUSt將細菌OTU豐度矩陣與KEGG數據庫比對，獲得菌群功能預測信息，用R軟件繪制聚類熱圖。

2 結果與分析

2.1 不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌物種聚類分析

2.1.1不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌物種聚類最小操作單元(OTU)分析

將不同質量和長度的秸稈覆蓋下的谷子根圍土壤細菌的測序有效數據聚類，共得到9 480個OTUs。OTUs序列的注釋結果中，能夠注釋到界水平的OTUs數目為8 212(占86.62%)，其中：門水平占74.56%；綱水平占66.18%；目水平占56.57%；科水平占46.37%；屬水平占26.10%;僅有506個OTU注釋到種水平。

土壤細菌物種花瓣圖見圖1?？芍?個處理共有的OTU數目為2 576，其中W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1、W3L3、CK特有的OTU數目分別為326、338、335、504、283、189及149，W2L3處理下較其他處理下的特異性細菌OTU數目最多。

花瓣圖中每個花瓣代表一個處理，不同的顏色代表不同的處理。中間的Core數字代表的是所有處理共有的OTU數目，花瓣上的數字代表該處理特有的OTU數目。In the petal diagram, each petal represents one treatment, and different colors represent different treatments. The core number in the middle represents the number of OTUs common to all treatments, and the number on the petal represents the number of OTUs unique to this treatment.圖1 土壤細菌物種花瓣圖Fig.1 Petal diagram of soil bacterial species

2.1.2不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌群落組成分析

細菌門水平物種相對豐度的結果見圖2。可知：相對豐度>1%的門類共有5門，分別是：變形桿菌門(Proteobacteria，占28.46%～36.36%)；酸桿菌門(Acidobacteria，占13.35%～18.48%)；放線桿菌門(Actinobacteria，占12.14%～14.01%)；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，占10.67%～13.98%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，占7.81%～10.60%)。所有處理下土壤細菌在門水平物種組成的優勢門相同，均為變形桿菌門、酸桿菌門、放線桿菌門和芽單胞菌門，但其相對豐度有差異(圖2)。雨水淋溶不同質量和長度的谷子秸稈，土壤細菌酸桿菌門相對豐度與CK相比均有不同程度的增加，增加幅度為1.12%～6.25%；土壤芽單胞菌門相對豐度與CK相比均有不同程度的減少，減少范圍為0.70%～3.10%，W2L3處理下變形桿菌門相對豐度比CK降低6.13%，放線桿菌門相對豐度比CK降低4.89%。

圖2 土壤細菌門水平上的物種相對豐度圖Fig.2 Relative abundance of soil bacterial community based on Phylum level

由細菌屬水平物種相對豐度的結果可知：相對豐度>1%的屬共有9屬，分別是：鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，占4.65%～7.63%)；目前綱科目未定的酸桿菌門(unidentified Acidobacteria，占2.66%～4.16%)；斯克爾曼氏菌屬(Skermanella，占1.21%～1.63%)；乳桿菌屬(Lactobacillus，占1.06%～2.58%)；黃色土源菌屬(Flavisolibacter，占1.00%～1.95%)；芽單胞菌屬(Gemmatimonas，占1.00%～1.68%)；馬賽菌屬(Massilia，占0.25%～1.11%)；Ramlibacter(占0.40%～1.03%)和溶桿菌屬(Lysobacter，占0.49%～1.06%)。各處理下土壤細菌在屬水平物種組成的優勢屬略有不同，為鞘氨醇單胞菌屬、目前綱科目未定的酸桿菌門、乳桿菌屬、黃色土源菌屬、芽單胞菌屬、斯克爾曼氏菌屬中的4～6屬，且優勢屬的相對豐度有較大差異，其中馬賽菌屬和Ramlibacter是CK處理下特有優勢屬，溶桿菌屬是W1L3處理下特有優勢屬。W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1和W3L3處理較CK處理鞘氨醇單胞菌屬相對豐度在5%顯著水平下均顯著下降，分別下降23.98%、39.06%、25.69%、32.24%、18.22%和20.58%；W1L3、W2L1、W3L1和W3L3處理下黃色土源菌屬相對豐度在5%顯著水平下較CK處理顯著下降71.90%、30.16%、47.62%和59.79%；W1L3、W2L3和W3L3處理下芽單胞菌屬相對豐度在5%顯著水平下較CK處理顯著下降45.24%、40.48%和10.71%。

2.2 不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌Alpha多樣性分析

2.2.1不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌稀釋曲線分析

不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌稀釋曲線見圖3。結果所示：不同質量和不同長度的秸稈覆蓋下土壤細菌稀釋曲線逐漸趨于平緩，說明測序數據量漸進合理，更多的數據量只會產生少量新的物種(OTUs)，基本可以反映出不同秸稈覆蓋處理下谷子根圍土壤細菌變化趨勢。隨測序數量的增加，物種數量先是急劇增加，后變得漸進平緩，說明各秸稈覆蓋處理下新的物種增加量已經很少，數據分析時均一化選取量(Cutoff=39 641)合理。測序條數在6 615以下時曲線急劇上升，各秸稈覆蓋處理的稀釋曲線基本重合，隨測序條數不斷增加，各秸稈覆蓋處理的稀釋曲線逐漸分離，其物種量的豐富程度出現差異，在測序條數達到26 430后，各秸稈覆蓋處理的稀釋曲線完全分離。6種秸稈覆蓋處理下，根圍土壤細菌物種量的豐富程度差異不明顯，W2L1秸稈覆蓋處理下土壤細菌物種量的豐富程度最高，對照(不覆蓋秸稈)處理下土壤細菌物種量的豐富程度最低，不同秸稈覆蓋處理下土壤細菌物種量的豐富程度由高到低的排列順序為：W2L1>W1L3>W2L3>W3L1>W1L1>W3L3>CK。

注：稀釋曲線中，橫坐標為從某個處理中隨機抽取的測序條數，縱坐標為基于該測序條數能構建的OTU數量，用來反映測序深度情況，不同的樣本使用不同顏色的曲線表示。Note：In the dilution curve, the horizontal coordinate is the number of sequencing numbers randomly selected from one treatment, and the vertical coordinate is the number of OTUs that can be constructed based on the number of sequencing numbers to reflect the sequencing depth. Different treatments are represented by curves in different colors.圖3 土壤細菌OTU稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of soil bacteria

2.2.2不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌Alpha多樣性指數分析

不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌Alpha多樣性指數組間差異箱型圖見圖4。由Alpha 多樣性指數分析可知：不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋后谷子根圍表層土壤細菌Alpha多樣性指數均>CK，說明秸稈覆蓋提高了谷子根圍土壤細菌群落豐富度及多樣性。反映群落豐富度的理論預估值(Chao1指數和ACE指數)在不同程度的受到秸稈雨水淋溶物質的影響，所有處理下ACE指數和Chao1指數的變化趨勢一致，但差異并不顯著，說明秸稈覆蓋下谷子根圍土壤細菌豐富度均有提高，且土壤細菌豐富度與秸稈覆蓋量呈現正相性關系(圖4)。結合土壤細菌屬水平上的物種相對豐度數據可知，各處理在屬水平群落均勻度增加，表現為相對豐度占比較高的綱科目未定的酸桿菌屬、斯克爾曼氏菌屬、乳桿菌屬與CK相比豐度增加，而鞘氨醇單胞菌屬、黃色土源菌屬、芽單胞菌屬與CK相比豐度減少。Shannon指數的各處理離散程度與CK相比均較小(圖4)。在1 cm長度(L1)的谷子秸稈覆蓋下，反映群落物種多樣性的Shannon指數和Simpson指數隨覆蓋質量的增加而增加，但是在5 cm 長度(L3)的秸稈覆蓋下，隨覆蓋質量的增加Shannon指數和Simpson指數先增加后減小。各處理的Shannon指數均>CK，但只有W1L3和W3L1處理與CK相比達到了差異顯著或極顯著水平；各處理間均未達到差異水平。W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1和W3L3的Simpson指數與CK相比均增加，但只有W1L3和W3L3處理與CK相比達到了差異顯著或極顯著水平；W2L3處理與W1L3、W3L3處理分別差異顯著或極顯著(圖4)。

圖4 Alpha多樣性指數組間差異箱型圖Fig.4 Box graph of Alpha diversity index between different group

2.3 不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌Beta多樣性分析

經NMDS分析可知：不同質量和長度的秸稈覆蓋下土壤細菌群落NMDS分析的應力值為0.102，擬合水平較理想，可以準確反映不同質量和長度的秸稈覆蓋下土壤細菌群落間的差異程度。不同質量和長度的秸稈覆蓋下的土壤樣本大體聚類為3組：W1L3、W2L3、W3L3 3種秸稈覆蓋量處理聚類在一起；W1L1、W2L1、W3L1 3種秸稈覆蓋量處理聚類在一起；CK單獨聚類，反映了不同質量和長度的秸稈雨水淋溶物對土壤細菌群落結構具有明顯的影響。從圖中各處理樣品點的相對位置可以看出W1L3、W2L3、W3L3的細菌物種組成更為相似且均距離CK較遠，說明不同秸稈長度和質量覆蓋還田后，W1L3、W2L3、W3L3處理與其他處理已明顯分開，細菌物種組成已出現差異；但其他處理仍有交叉，細菌物種組成差異不明顯。

2.4 不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌群落PICRUSt功能預測

2.4.1功能基因家族組成

將預測得到的功能基因家族與KEGG數據庫比對發現，第一等級上，所有菌群的基因序列注釋到的功能可分為6類，其中前3類分別是：新陳代謝、遺傳信息加工和環境信息加工。第二等級上，參與新陳代謝的菌群中，以參與碳水化物代謝、氨基酸代謝和能量代謝的為最大類群；參與遺傳信息加工的菌群中，參與翻譯類群具有明顯優勢，其次是復制和修復的類群；參與環境信息加工的菌群中，參與膜轉運和信號轉導的類群具有明顯優勢。

2.4.2代謝相關基因分析

對不同質量和長度的秸稈覆蓋下的土壤樣品的KEGG直系同源基因簇(KEGG orthologous groups)豐度熱圖(圖5)分析發現，碳水化物代謝、氨基酸代謝和能量代謝通路上的相關基因表達差異較為顯著；各土壤樣品可大致聚為W3L1、W3L3、CK和W1L1、W1L3、W2L1、W2L3 2類，秸稈化感物質明顯降低代謝相關基因豐度，其中W2L1秸稈覆蓋處理下代謝相關基因豐度與其他6個處理具有明顯劣勢。對該處理下劣勢基因所對應的酶進行篩選并歸類，得到：與脂肪酸合成代謝相關的酰基載體蛋白還原酶(K00059)，與能源物質代謝相關的重要中間代謝物乙酰CoA(K00626)，具有特異催化蛋白質底物功能(絲氨酸、蘇氨酸羥基磷酸化)的蛋白激酶(K08884)，作用于支鏈氨基酸(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)轉運系統中的酶(K01955、K00265、K01915)，參與肽/鎳轉運系統底物結合和滲透的酶蛋白(K02035)，參與蛋白質及氨基酸代謝相關蛋白(K00548)。

KEGG直系同源基因簇(KO)豐度熱圖中，橫坐標表示所測土壤樣本,縱坐標表示代謝相關基因所對應的酶。In the abundance heatmap of KEGG orthologous groups (KO) cluster, the horizontal coordinate represents the soil samples tested, and the vertical coordinate represents enzymes corresponding to metabolism-related genes.圖5 不同土壤樣本細菌群落KEGG直系同源基因簇(KO)豐度熱圖Fig.5 Abundance heatmap of KEGG orthologous groups (KO) cluster for different soil samples bacterial community

3 討 論

3.1 秸稈化感物質對谷子根圍表層土壤細菌群落組成及多樣性的影響

作為農田生態系統的重要組成部分，土壤微生物在土壤有機質形成和轉化、土壤養分循環等方面發揮著至關重要的作用[31]。同時，土壤微生物群落組成及活性變化是衡量土壤質量和其生態系統功能的關鍵性指標之一[32]。秸稈中的營養物質可在還田后為土壤微生物提供豐富的營養物質，提高群落多樣性和豐富度以及土壤微生物代謝能力[33]。沈曉琳等[34]的研究表明，秸稈還田提高了土壤團聚體細菌和真菌生物量，改善了土壤團聚體微生物群落結構，增加了土壤固碳能力和保持土壤微生物多樣性。本研究中各樣品中細菌群落共有的OTUs種類占自身比例較小，特有的OTUs種類較多。物種注釋結果表明：所有處理下土壤細菌在門水平物種組成的優勢門相同，均為變形桿菌門、酸桿菌門、放線桿菌門和芽單胞菌門，但相對豐度有差異。雨水淋溶不同質量和長度的谷子秸稈，增加了土壤細菌酸桿菌門的相對豐度，減少了土壤芽單胞菌門的相對豐度。不同秸稈覆蓋處理下，谷子根圍土壤細菌群落內的豐富度分析中，土壤細菌豐富度指數的分析表明秸稈覆蓋處理為W1L3和W2L3時能讓細菌的豐富度維持在較高水平。秸稈還田不僅為土壤提供營養物質，供給植物和微生物生長，同時秸稈在雨水淋溶之后化感物質滲入地表，低濃度的化感物質能促進微生物的生長發育和繁殖，高濃度的化感物質抑制微生物的生長發育和繁殖，導致微生物群落豐富度下降。從土壤細菌群落間多樣性分析來看，相比無秸稈覆蓋處理下，在秸稈覆蓋量為W1L3及W2L1處理下細菌群落多樣性較高，土壤細菌多樣性明顯提高，秸稈覆蓋量小，雨水淋溶化感物質少，促進了土壤細菌多樣性。不同質量和長度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細菌群落結構圖和NMDS分析都表明W1L3和W3L1秸稈覆蓋處理時土壤細菌群落組成優勢屬差異較大，但其群落結構較其他秸稈覆蓋處理更加穩定。因此，W1L3和W3L1秸稈覆蓋處理更有利于提高細菌群落的多樣性和維持細菌群落的均勻度和穩定性。綜合群落內和群落間的分析，當秸稈覆蓋量為W1L3和W3L1秸稈覆蓋處理時，秸稈雨水淋溶物化感作用促進土壤細菌群落豐富度較高，細菌的多樣性較高和均勻度較好且群落比較穩定。

3.2 功能預測

KEGG豐度熱圖的初步分析發現W2L1秸稈覆蓋處理的多種與碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝的酶基因相對豐度具有明顯劣勢。?；d體蛋白還原酶能從頭合成脂肪酸[35]。乙酰CoA是代謝過程中的一個關鍵節點，與許多代謝途徑和轉化相互交叉[36]。這些功能酶在土壤細菌中存在，使得土壤中碳水化合物的代謝和脂類代謝得到促進。本研究中上述酶基因豐度較不覆蓋秸稈處理明顯減少，表明在W2L1處理產生的秸稈淋溶物減少了土壤中與碳代謝有關的細菌類群，抑制了碳源利用能力。氨基酸作為土壤微生物的優良碳源和氮源[37]，能促進土壤微生物活動，增加土壤微生物數量[38]。氨基酸的合成是碳代謝與氮代謝的樞紐[39]。本研究表明，W2L1處理產生的秸稈淋溶物減少了土壤中與碳代謝及氮代謝相關細菌，抑制土壤碳、氮代謝。此外，鎳元素能促進氮素轉運，參與尿素的水解過程，缺乏鎳元素會導致植物體內尿素的積累[40-42]，鈦元素可以增加葉綠素含量、提高光合效率，增強植物細胞活力[39]。本研究表明，W2L1處理產生的秸稈淋溶物與CK相比降低了鈦、鎳元素轉運相關的酶基因豐度，抑制了土壤中微量元素鈦和有益元素鎳的利用。

4 結 論

谷子秸稈的雨水淋溶物可以改善土壤細菌群落結構，提高其群落多樣性，尤以W1L3(2 000 kg/hm2秸稈覆蓋量、鍘切長度5 cm)處理產生的雨水淋溶物化感促進效果較好，且W3L1(4 000 kg/hm2秸稈覆蓋量、鍘切長度1 cm)處理產生的秸稈淋溶物對碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝通路上的相關基因表達的化感抑制效果較為顯著。