病毒性腦炎患兒血清RANTES、Eotaxin表達水平及其臨床意義

鄭惠心，孫嵩，陳玉雯，馮小偉

病毒性腦炎(viral encephalitis，VE)是由多種病毒毒素侵襲腦實質或軟腦膜導致的神經系統感染性疾病，也是導致兒童神經功能受損或死亡的主要因素之一[1]。因此尋找合適的血清指標快速準確地評估VE的嚴重程度和預后對早期干預治療至關重要。T細胞正常表達和分泌刺激因子(regulation on activation normal T-cell expressed and secreted，RANTES)可使多種白細胞活化，促進炎性反應；同時也能夠抑制病毒在機體內的復制過程[2]。研究表明[3]，RANTES能夠結合其特異性受體C-C趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)，促進T細胞表面CD34和CD44表達；同時增強炎性細胞與感染組織細胞的黏附性，從而加速炎性反應進展。嗜酸性粒細胞趨化因子(eosinophil chemoattractant chemokine，Eotaxin)屬于趨化因子C-C 家族成員，其編碼基因位于17q21，在Th1和Th2型細胞膜表面表達，能夠參與效應T細胞的活化、分化及遷移，誘導并促進細胞免疫的發生[4]。研究表明[5]，Eotaxin對淋巴細胞、Th2型細胞及嗜堿性粒細胞均具有較強的催化作用，并誘導以上細胞合成釋放組胺，促進肥大細胞生長，分泌過敏介質，從而調節速發型過敏性炎性反應。

目前，RANTES和Eotaxin在VE中研究罕見，且對其嚴重程度及預后的影響尚不清楚。因此，現觀察VE患兒血清中RANTES和Eotaxin的表達，并分析其與VE嚴重程度的關系及對預后不良的診斷效能，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月—2020年5月海南省人民醫院兒科收治VE患兒101例作為VE組，同時選取醫院同齡體檢健康兒童97例作為健康對照組。VE組男60例，女41例，年齡2～11(7.05±1.81)歲；重癥45例(表現為驚厥、昏迷及定向力障礙)，輕癥56例(表現為頭痛、發熱、腹瀉等非特異性癥狀)。健康對照組男55例，女42例，年齡3～10(7.11±1.72)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核批準(2017-007)，受試兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合《神經病學》[6]中對VE的診斷標準及嚴重程度評估；②VE病程均<7 d，且既往未經治療；③既往3個月內無外科手術史。(2)排除標準：①先天性免疫系統缺陷者；②伴有肺炎、腎炎等其他部位急性感染者；③合并腦膿腫、結核性腦膜炎者；④2周內服用糖皮質激素或抗生素藥物者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清RANTES、Eotaxin水平檢測：VE患兒于入院當日、健康對照組于體檢當日空腹狀態下采集靜脈血10 ml置于抗凝管中，離心收集上層清液，將其置于-80℃冰箱中保存。通過酶聯免疫法檢測血清RANTES、Eotaxin水平。

1.3.2 實驗室相關指標檢測：上述血清采用全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司，型號COBAS INTEGRA 800)檢測血清白細胞(WBC)計數、肌酸激酶腦型同工酶(CK-BB)、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、神經元特異性烯醇化酶(neuronal specific enolase，NSE)。

1.4 預后評估 通過電話或門診進行隨訪。隨訪時間為3個月或VE患兒死亡截止。采用格拉斯哥預后量表(Glasgow outcome scale，GOS)[7]評估VE患兒預后。死亡為1分；植物人生存狀態為2分；重度殘疾，日常生活不能自理為3分；輕度殘疾，但是可以獨立生活為4分；恢復良好，正常生活為5分。其中1～3分為預后不良，4～5分為預后良好。

2 結 果

2.1 2組受試者血清RANTES、Eotaxin比較 VE組血清RANTES、Eotaxin水平均高于健康對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 健康對照組及VE組血清RANTES、Eotaxin水平比較

2.2 不同病情VE患兒臨床資料比較 不同病情VE患兒性別、年齡、WBC比較，差異無統計學意義(P>0.05)，重癥VE患兒血清CK-BB、NSE、MBP及RANTES、Eotaxin均高于輕癥患兒(P均<0.01),見表2。

表2 不同病情嚴重程度VE患兒臨床資料比較

2.3 血清RANTES、Eotaxin水平與神經損傷相關指標的相關性 VE患兒血清RANTES、Eotaxin水平與CK-BB、NSE及MBP均呈正相關(P均<0.01)，見表3。

表3 VE患兒血清RANTES、Eotaxin水平與神經損傷相關指標的相關性

2.4 影響重癥VE的獨立危險因素分析 二元Logistic多因素回歸分析顯示，血清RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP升高是重癥VE的獨立危險因素(P均<0.05)，見表4。

表4 二元Logistic回歸模型分析重癥VE的獨立危險因素

2.5 血清RANTES、Eotaxin水平對VE患兒預后不良的診斷價值 以VE患兒是否發生預后不良為因變量，以上述2項指標為自變量，繪制ROC曲線。血清RANTES、Eotaxin的最佳截斷值分別為300 ng/L、183.5 ng/L，AUC分別為0.784、0.761，二者聯合的AUC為0.863，優于單一指標預測VE患兒發生預后不良的效能(Z=6.233、5.490，P均<0.001)，見圖1、表5。

表5 血清RANTES、Eotaxin水平對預后不良VE患兒的診斷價值

圖1 血清RANTES、Eotaxin水平對VE患兒預后不良的診斷價值

3 討 論

據流行病學調查發現，我國是VE的高發國家，其年均發病率為3.5/10萬～7.4/10萬，以夏秋季為主，存在一定的區域性及病原譜差異。VE在初期癥狀較隱匿，疾病進展迅速，且臨床癥狀多樣，易導致多種臟器功能障礙，致殘率較高。VE的發病機制較復雜，涉及體液免疫、細胞免疫、炎性因子、細胞因子等多種因素之間的相互作用[1]。目前，針對VE嚴重程度和預后的評估主要以臨床癥狀、腦電圖及腦脊液檢查為主，耗時長，具有一定的誤差性。因此，發現合適的生化指標對VE的病情評估及預后分析具有重要價值。

RANTES是一種長鏈糖蛋白，其編碼基因位于17q11.2上，結構呈高度保守性，在多種細胞中均能轉錄合成，能夠誘導多種炎性因子和細胞活化，促進局部免疫損傷[2]。動物實驗表明[2]，RANTES能夠誘導特異性的CD8+T細胞合成，并定向趨化移動至流感病毒侵襲組織處，促進特異性免疫反應的發生。Ajamian等[3]發現，RANTES能夠促進嗜酸性粒細胞分化，并使其遷移至支氣管肺泡灌洗液及上呼吸道內，加重哮喘的嚴重程度。本研究發現，VE組血清RANTES水平較健康兒童高，提示RANTES可能在VE發病時具有一定作用。其原因可能是病毒毒素透過血腦屏障時刺激抗原遞呈細胞，經其遞呈至巨噬細胞，使巨噬細胞活化，通過內質網合成分泌大量的RANTES，并釋放入血，使血清中RANTES水平升高[8]。且本研究結果表明，血清RANTES隨患兒病情的加重而升高，提示RANTES可能參與調控VE的進展，與Kalita等[8]的研究結果相符。其原因可能是RANTES能夠激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，使其磷酸化并遷移至細胞核內，促進核轉錄因子κB(nclear factor-kB，NF-κB)活化，促進炎性反應進展，加重腦組織的損傷程度[9]。Dao等[10]發現，RANTES能夠促進細胞因子分泌，并誘導其與信號傳導及轉錄活化因子(signal transducers and activators of Transcription, STAT)結合，使STAT發生二聚體化，釋放γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)，增強炎性反應的程度。

Eotaxin是一種β趨化因子，由72個氨基酸殘基組成，由巨噬細胞和嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)合成分泌，與人膜輔助蛋白具有高度同源性，對EOS具有選擇性化學趨化作用[11]。Eotaxin通過結合其特異性受體趨化因子受體3(chemokine receptor 3，CCR3)，促進干細胞分化成EOS，以滾動、黏附及滲出的方式向外周循環遷移，并作用于內皮細胞，在病毒或病菌累及的組織中大量聚集，發揮相應的生物學效應[12]。Molina-Infante等[4]發現，CCR3拮抗劑使EOS的趨化、募集受阻，遲發性變態反應的程度減輕，同時分化成EOS的比例也呈下降趨勢。本研究結果表明，VE患兒血清Eotaxin水平高于健康兒童，提示Eotaxin可能參與調控VE的發病過程，這與Cui等[5]的研究結果一致。其原因可能是病毒入侵腦實質后單核細胞活化，經過信號通路轉導激活NF-κB，使Eotaxin mRNA的啟動子活化，啟動轉錄翻譯過程，合成Eotaxin并釋放入血，提高血清中Eotaxin水平[13]。同時，重癥VE患兒血清Eotaxin水平高于輕癥患兒，提示Eotaxin可能在VE的進展過程中發揮一定作用。其原因可能是Eotaxin能夠激活CCR3，促進EOS浸潤感染組織，誘導EOS發生脫顆粒作用，合成并釋放大量的蛋白酶、炎性介質及內源性刺激物，損傷腦實質，加重VE的嚴重程度[12,14]。此外，Eotaxin能夠促進硝基酪氨酸及一氧化氮合酶合成，誘導氧化應激反應，釋放活性氧，使腦膜和腦組織發生局部氧化損傷，導致病情加重[5,14]。

二元Logistic回歸分析顯示，血清RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP升高是重癥VE的獨立危險因素(P均<0.05)，提示血清中RANTES、Eotaxin、CK-BB、NSE及MBP水平高低是影響VE嚴重程度的重要因素，這對評估重癥VE患兒具有重要幫助。Pearson相關分析顯示，VE患兒血清中RANTES、Eotaxin水平與神經損傷指標存在相關性，可能對輔助判斷神經損傷情況具有一定幫助。其原因是RANTES能夠結合細胞外基質中的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，誘導肥大細胞和單核細胞經血腦屏障趨化運動至病毒侵襲的腦實質處，釋放大量的炎性因子，破壞腦內血管內皮細胞，損傷腦實質細胞及神經纖維細胞，使腦神經功能受損[15-16]。Eotaxin-CCR3軸能夠激活細胞外信號調節激酶2和分裂素活化蛋白激酶，誘導白介素13大量釋放聚集，使神經細胞變性或凋亡，同時，促進Ca2+內流，增強肥大細胞對腦組織的黏附性及反應性，使肥大細胞產生的組胺及炎性因子直接損傷腦實質細胞及神經纖維細胞，加重腦神經功能損傷程度[17-18]。ROC曲線顯示，血清RANTES聯合Eotaxin能夠提高VE患兒發生預后不良的診斷價值。同時，本研究還發現，RANTES聯合Eotaxin的敏感度和特異度均較高，彌補了單一指標敏感度或特異度不高的缺陷，提示2指標聯合應用對早期評估VE患兒發生預后不良具有較高預測價值。

總之，VE患兒血清中RANTES和Eotaxin均升高，且是重癥VE的獨立危險因素。同時，血清中RANTES和Eotaxin水平能夠在一定程度上反映神經功能受損程度。血清RANTES聯合Eotaxin對VE患兒發生預后不良具有良好的診斷效能，且診斷的真實性可靠，為臨床實施進一步治療提供有利支持。但由于試驗設備及試驗條件有限，VE患兒血清中RANTES和Eotaxin變化的具體機制尚不清楚，需要在接下來的基礎實驗中逐步證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

鄭惠心：提出研究方向、研究思路，設計研究方案，論文撰寫；孫嵩：提出研究思路，數據收集，分析整理，進行統計學分析；陳玉雯：實施研究過程，參與文獻調研與整理；馮小偉：設計研究方案，參與實施研究過程，論文修改