NLRP3炎性小體水平檢測在非霍奇金淋巴瘤患者免疫治療相關細胞因子風暴及化療相關間質性肺炎中的預測價值分析

張艷彬，陳文昆，周寅，張小娟，李魁星

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是一種具有惡性增殖性、高度異質性的淋巴系統腫瘤，多采用放療、化療治療，雖可使部分患者獲得長期生存，但難以徹底清除腫瘤細胞，且治療期間易損傷機體正常細胞，產生化療相關間質性肺炎(interstitial pneumonia，IP)等諸多毒副作用[1-2]。嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)作為一種新興免疫治療方案，可特異性識別靶抗原、殺傷靶細胞，在治療難治性、復發惡性淋巴瘤中的完全緩解率高達90%[3]。但CAR-T治療后的細胞因子風暴(cytokine release syndrome，CRS)發生率較高，患者臨床常表現為凝血功能異常、肝腎功能受損、發熱等，重度CRS可出現多器官功能障礙，甚至危及患者生命[4-5]。因此，早期預測、識別及干預IP、CRS等不良反應是NHL患者免疫治療、化學治療成功的關鍵環節。炎性體信號通路的異常激活在諸多炎性疾病的發生、發展過程中發揮關鍵作用，其中NOD樣受體家族3(NLRP3)炎性小體激活后可加快IL-18等炎性因子的分泌及成熟，加劇炎性反應及組織損傷，故積極探討相關炎性體信號通路的激活機制及表達可指導臨床診治[6-7]。目前關于NLRP3炎性體信號通路的激活機制研究較少，且少見有關其在CRS、IP中的研究報道。鑒于此，本研究就NLRP3炎性小體水平檢測在NHL患者免疫治療相關CRS及化療相關IP中的預測價值進行分析，旨在為CRS、IP的防治提供一個潛在的靶點，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年3月—2021年4月在北京協和醫院血液內科接受CAR-T免疫治療聯合化療的NHL患者125例臨床資料，其中男68例，女57例；年齡39～79(53.65±6.27)歲；病程8～24(15.32±2.15)個月；淋巴瘤國際預后指數(IPI)評分(2.68±0.24)分；體質量指數(BMI)(21.03±1.68)kg/m2；疾病類型：彌漫大B細胞淋巴瘤101例，NK/T細胞淋巴瘤7例，濾泡淋巴瘤14例，淋巴漿細胞淋巴瘤3例。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：符合NHL相關診斷標準[8-9]；化療前胸部CT顯示無IP及嚴重感染表現；臨床資料完整。(2)排除標準：胸部CT顯示有間質性改變，但未伴有任何臨床表現；化療期間新發真菌性、細菌性、病毒性肺部感染；難以耐受CAR-T免疫治療聯合化療；伴有心、肝、腎等重要臟器功能障礙或器質性病變；伴有意識障礙、精神障礙、活動困難；妊娠期或哺乳期女性。

1.3 分組方法 (1) CRS ：生命體征平穩，發熱和/或1級臟器毒性，無低血壓發生為1級CRS；2級臟器毒性，血壓降低和缺氧，使用低劑量升壓藥或靜脈補液可糾正低血壓，吸氧濃度<40%為2級CRS；3級臟器毒性，血壓降低和缺氧，使用大劑量升壓藥可糾正低血壓，吸氧濃度≥40%為3級CRS；4級臟器毒性，需呼吸機輔助呼吸，生命體征難以維持為4級CRS[10-11]。將發生1～4級CRS的患者99例納入CRS組，其余26例為非CRS組。(2)IP[12]：①臨床表現為咳嗽、氣促、咯痰、發熱、胸悶等；②胸部CT表現兩肺伴有斑片狀、蜂窩狀、網格狀、磨玻璃影，可伴或不伴有肺氣腫、胸膜增厚征、牽拉性支氣管擴張、肺大泡。結合胸部CT確診IP 28例為IP組，未確診IP 97例為非IP組。

1.4 治療方法

1.4.1 CAR-T免疫治療：輸入前采用FC方案對腫瘤負荷進行預處理，CAR-T細胞均為患者來源，回輸前第14 d，采集患者外周血淋巴細胞，送至實驗室進行基因修飾，CAR-T細胞由北京億鳴復興生物科技有限公司制備，細胞結構包括4-1BB/CD3ζ信號區、抗CD19 scFv、跨膜區；使用轉錄的病毒為慢病毒；回輸前1 d休息；分3次進行CAR-T細胞回輸治療(第0、1、2 d分別回輸總劑量的10%、30%、60%)，CAR-T細胞回輸總數為0.62(0.39～1.30)×106個/kg；回輸當日，使用鹽酸異丙嗪、吲哚美辛栓藥物，以預防過敏反應。

1.4.2 化療方案：第1 d，環磷酰胺750 mg/m2，多柔比星40～50 mg/m2，長春地辛3～4 mg；第1～5 d，地塞米松15 mg。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 NLRP3炎性小體檢測：治療前采集患者外周血3 ml，置于EDTA抗凝試管，置于離心機中1 500 rpm×10 min，取血漿置于1.5 ml無菌EP管。參考Trizol試劑盒、總RNA提取試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)說明書提取血漿中總RNA，使用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，按說明書進行操作。以逆轉錄的cDNA為模板，用熒光定量PCR技術(PRISM 7000型定量PCR儀)檢測NLRP3炎性小體表達水平，總反應體系為20 μl，將β-actin作為內參，上游:5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3'，下游:5'-GCCCCATCTAACCCATGCTTC-3'。NLRP3上游:5'-GAGTTCTTCGCTGCTATGT-3'，下游:5'-ACCTTCACGTCTCGGTTC-3'。凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)上游：5'-CAACTGCGAGAAGGCTAT-3'，下游:5'-GTGACCCTGGCAATGAGT-3'。半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)上游:5'-TGGAAGGTAGGCAAGACT-3'，下游:5'-ATAGTGGGCATCTGGGTC-3'。PCR條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，共39個循環，72℃ 5min，收集熒光信號，用2-ΔΔCt法計算外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達。

1.5.2 炎性因子檢測：治療后采集患者外周血3 ml，置于離心機中3 000 rpm×5 min，取上清，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清白介素(IL)-6、IL-10、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，試劑盒購自科邦興業(北京)科技有限公司；采用免疫比濁法測定C反應蛋白(CRP)水平，試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.5.3 血常規及生化指標檢測：采集患者治療后外周血，采用COULTER LH 780/LH 785血細胞分析儀[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]測定中性粒細胞計數(N)、血小板計數(PLT)、單核細胞計數(MON)、淋巴細胞計數(L)水平；采用ELISA法測定白蛋白(Alb)水平，采用速率法(上海梵態生物科技有限公司)測定α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)、乳酸脫氫酶(LDH)水平。

2 結 果

2.1 CRS組、非CRS組一般資料比較 CRS組性別、年齡、病程、IPI評分、BMI、疾病類型與非CRS組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 CRS組、非CRS組一般資料比較

2.2 CRS組、非CRS組NLRP3炎性小體各基因mRNA表達比較 CRS組外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達水平均高于非CRS組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 CRS組、非CRS組NLRP3炎性小體各基因mRNA表達比較

2.3 CRS組、非CRS組炎性細胞因子表達比較 CRS組外周血CRP、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平均高于非CRS組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 CRS組、非CRS組炎性細胞因子表達比較

2.4 CRS組、非CRS組血常規及血生化指標比較 CRS組PLT、N、MON、L、α-HBDH、Alb水平與非CRS組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；CRS組LDH水平高于非CRS組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 CRS組、非CRS組血常規及血生化指標比較

2.5 NLRP3炎性小體表達與炎性細胞因子、血生化指標水平相關性 雙變量Preason相關性顯示，CRS患者外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達均與CRP、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、LDH水平呈正相關(P<0.01)，見表5。

表5 NLRP3炎性小體表達與炎性細胞因子、血生化指標水平相關性

2.6 IP組、非IP組一般資料比較 IP組性別、年齡、病程、IPI評分、BMI及疾病類型與非IP組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

表6 IP組、非IP組一般資料比較

2.7 IP組、非IP組NLRP3炎性小體各基因mRNA表達比較 IP組外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達水平均高于非IP組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表7。

表7 IP組、非IP組NLRP3炎性小體各基因mRNA表達比較

2.8 IP組、非IP組血常規及血生化指標比較 IP組血常規、血生化相關指標水平與非IP組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表8。

表8 IP組、非IP組血常規及血生化指標比較

2.9 IP組、非IP組炎性細胞因子表達比較 IP組外周血CRP、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平均高于非IP組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表9。

表9 IP組、非IP組炎性細胞因子表達比較

2.10 NHL患者CRS、IP發生的危險因素分析 將單因素分析中有統計學意義的指標納入自變量，將NHL患者是否發生CRS、IP作為因變量，經Logistic回歸分析顯示，NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達升高均為影響NHL患者CRS、IP發生的危險因素(P<0.05)，見表10、11。

表10 影響NHL患者CRS發生的多因素分析

2.11 NLRP3炎性小體表達預測NHL患者CRS、IP發生的價值 ROC曲線分析結果顯示，NLRP3、ASC、Caspase-1及三者聯合預測NHL患者CRS發生的AUC分別為0.890、0.715、0.800、0.916，預測IP發生的AUC分別為0.901、0.868、0.880、0.935，見表12、圖1、圖2。

圖1 NLRP3炎性小體預測CRS的ROC圖

圖2 NLRP3炎性小體預測IP的ROC圖

表11 影響NHL患者IP發生的多因素分析

表12 NLRP3炎性小體基因表達預測NHL患者CRS、IP發生的價值分析

3 討 論

正常狀態下，機體抗炎性細胞因子與促炎性細胞因子保持相對平衡，當病毒、細菌等侵入機體后可導致諸多免疫細胞激活，釋放大量細胞因子，當體內細胞因子到達某一閾值即可引起CRS。而IP的發生也與炎性因子密切相關，故從該角度而言2種疾病的發生機制存在一定共性。現有研究發現，炎性小體與動脈粥樣硬化、慢性關節炎等炎性疾病及腫瘤密切相關[13]。NLRP3炎性小體是目前研究熱點，其常表達于單核細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞中，是由Caspase-1、ASC及NLRP3組成的蛋白復合物，其可通過調節適應性免疫及固有免疫、腸道微生物、細胞凋亡等生物學行為影響腫瘤進程，其活化介導的炎性反應可影響腫瘤發生、進展、侵襲、轉移等階段[14-15]。關于NLRP3炎性小體與CRS、IP關系的研究是近年來國內外新的方向及思路，相關報道少見。

CAR-T免疫療法是一種精準型靶向治療腫瘤細胞技術，通過提取患者自身T淋巴細胞，實驗室培養后回輸至患者體內，以達到攻擊自身腫瘤細胞的目的。Neelapu等[16]研究發現，101例彌漫性大B細胞淋巴瘤經CAR-T細胞免疫治療后的完全緩解率、總體反應率分別為54%、82%，18個月總生存率為52%。肖霞等[17]研究報道，22例B細胞淋巴瘤輸注CAR-T細胞后總體完全緩解率、部分緩解率、總有效率分別為45.5%、31.8%、77.3%，但CRS的發生率為63.6%。目前，臨床針對CRS的發病機制尚未完全闡明，多認為與免疫細胞過度激活、細胞因子大量釋放等有關。Hu等[18]研究發現，CAR-T細胞的單鏈抗體可變區片段與腫瘤細胞表面的靶抗原相結合后，可促使IL-10、IFN-γ、IL-6等炎性細胞因子大量分泌，導致抗炎、促炎細胞因子失衡，進而造成劇烈的炎性免疫反應發生。Shimabukuro-Vornhagen等[19]研究報道，CAR-T治療后CRS的發生與靶細胞直接裂解所釋放的IFN-γ、IL-6等因子有關，且還可能由活化的T細胞釋放的趨化因子及促炎細胞因子刺激內皮細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞活化所誘導。本研究中，CRS組外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達及CRP、IL-6、IL-10等炎性細胞因子水平均高于非CRS組，NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達水平均與炎性細胞因子水平呈正相關，且三者升高是CRS發生的危險因素，聯合預測CRS發生的AUC為0.916，可見NLRP3炎性小體的活化在CRS患者CRP、IL-6等各種炎性因子的釋放及成熟過程中發揮重要作用，且可有效預測CRS的發生。推測其原因可能在于NLRP3通路信號被激活后可經 Caspase-1水解前體IL-18、前體IL-1β等，使其成為具有活性的IL-18、IL-1β，進一步誘導相關細胞因子的加工分泌、細胞凋亡，從而調節固有免疫系統過程，加劇炎性反應。

國內外關于NHL患者化療后IP發生率的報道不一，蒙延娜等[20]研究報道，彌漫大B細胞淋巴瘤接受RCHOP、RCDOP化療方案后的IP發生率分別為2.60%、28.95%。Huang等[21]研究報道，NHL患者化療后IP發生率為4.9%。臨床針對化療相關IP的診斷以影像學特點、臨床表現為主，但仍面臨一定挑戰，如影像學特征中的磨玻璃樣表現與肺孢子蟲感染或病毒性感染相似，臨床癥狀與感染性肺部疾病難以鑒別。近年來，不斷有研究證實，NLRP3炎性小體與肺部疾病相關。張燕等[22]研究報道，NLRP3 mRNA可能參與活動期結核的炎性反應過程。張帆等[23]研究發現，NLRP3炎性小體促分泌產物IL-18、IL-1β可有效預測風濕性關節炎合并IP。本研究中，IP組外周血NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表達水平均高于非IP組，且NLRP3炎性小體預測化療相關IP發生的AUC為0.935，可見NLRP3炎性小體表達在IP的發生中發揮重要作用，推測其機制可能與炎性小體的激活物和/或炎性小體的效應產物均存在于IP患者的氣道中，可伴隨炎性因子活性增加并與炎性小體的信號通路激活有關；此外，NLRP3炎性小體可通過活化后產生的IL-1β等炎性因子調控TGF-β表達，促進成纖維細胞活化為肌成纖維細胞，合成分泌細胞外基質，促進基質沉積，從而導致肺纖維化，誘發IP。但本研究為單中心、回顧性分析，且納入的樣本量較少，導致結果存在一定偏倚，故后期需進一步展開前瞻性、大樣本量的臨床研究。

綜上所述，NHL初診時NLRP3炎性體信號通路的異常活化與炎性細胞因子水平相關，且NLRP3炎性小體表達水平是影響CRS及IP發生的危險因素，可有效預測CRS及IP發生。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張艷彬：提出研究思路，設計研究方向，課題設計，論文撰寫；陳文昆：設計研究方案、研究流程；周寅：實施研究過程，資料搜集整理；張小娟：分析整理試驗數據，進行統計學分析；李魁星：課題設計，論文審核，論文修改