外周血PD-1、PD-L1表達與腎細胞癌骨轉移的相關性分析

朱云，吳東娟，馬帥軍，張夢姣

腎細胞癌是起源于腎小管上皮組織的惡性腫瘤，占所有腎癌的 90%，20%～30%的腎細胞癌患者以轉移性腎細胞癌就診，20%～40%局部病變患者在手術后最終會發展為轉移性病變[1]。骨骼是除肺外腎細胞癌第二常見的轉移部位，發生率為24%～32%，骨轉移可引起嚴重骨骼破壞，嚴重降低患者生活質量[2]。腫瘤細胞可通過將其免疫檢查點與T細胞上表達的受體結合來抑制T 細胞激活，導致免疫逃逸[3]。程序性死亡分子-1(programmed cell death protein 1，PD-1)通過調節T細胞活性，促使抗原特異性T細胞凋亡，抑制免疫反應和促進自身耐受，程序性死亡分子-1配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是免疫反應的協同抑制因子，與PD-1結合減少PD-1陽性細胞增殖，抑制細胞因子分泌并誘導細胞凋亡，PD-1/PD-L1軸與惡性腫瘤免疫逃逸、發生和進展密切相關[4]。現有研究顯示，透明細胞腎細胞癌外周血和腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達均增高[5]，但其表達是否與腎細胞癌骨轉移有關尚不清楚，鑒于此，現分析腎細胞癌患者外周血PD-1、PD-L1表達及其與腎細胞癌骨轉移的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月—2021年3月中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院泌尿外科收治腎細胞癌患者219例，其中發生骨轉移66例(骨轉移組)，未發生骨轉移153例(無骨轉移組)。骨轉移組患者均經放射性核素骨顯像或PET-CT證實骨轉移，并且骨轉移灶經病理證實，符合“腎癌骨轉移臨床診療專家共識(2008版)”[6]。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(PZ021541)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①經術后病理學證實為腎細胞癌；②年齡18歲以上。(2)排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②臨床資料及病理資料缺失者；③合并自身免疫疾病者，接受PD-1抑制劑治療者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 臨床資料收集：收集性別、年齡、體質量指數、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、組織學類型、TNM分期、肌肉或骨痛癥狀、堿性磷酸酶升高(>125 U/L)、高鈣血癥(>2.75 mmol/L)等臨床資料。

1.3.2 外周血CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1表達及CD14+單核細胞表面PD-L1表達檢測：患者入組后24 h內采集外周血3 ml注入EDTA抗凝試管混勻后加入RPMI-1640培養液(購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司)100 μl混勻，加入CD4-FITC/PD-1-PE、CD8-FITC/PD-1-PE和CD14-FITC/PD-L1-PE單克隆抗體(購自武漢艾美捷科技有限公司)4℃反應20 min。設陰性對照管，每個陰性對照管中分別加入CD4-FITC/IgG-PE、CD8-FITC/IgG-PE或CD14-FITC/IgG-PE，避光反應20 min。每管內加入紅細胞lysis Buffer(美國Beckman-Coulter公司)150 μl混勻，42℃水浴反應10 min，磷酸鹽緩沖液洗滌，3000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)棄上清，加入磷酸鹽緩沖液500 μl重懸。EPICS-XL 流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞表面PD-1表達率及CD14+單核細胞表面PD-L1表達率。

2 結 果

2.1 2組臨床資料比較 骨轉移組患者年齡≥65歲、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有肌肉或骨痛癥狀、堿性磷酸酶升高、高鈣血癥比例高于無骨轉移組(P<0.05)，2組性別、體質量指數、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、組織學類型比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 骨轉移組和無骨轉移組臨床資料比較 [例(%)]

2.2 2組外周血CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1及CD14+單核細胞表面PD-L1表達率比較 骨轉移組外周血CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1及CD14+單核細胞表面PD-L1表達率均高于無骨轉移組(P<0.01)，見表2、圖1。

注：A、B、C分別為無轉移組CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1及CD14+單核細胞表面PD-L1表達比例；D、E、F分別為骨轉移組CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1及CD14+單核細胞表面PD-L1表達比例

表2 骨轉移組和無骨轉移組外周血細胞表面PD-1/PD-L1表達率比較

2.3 腎細胞癌發生骨轉移的多因素Logistic回歸分析 以年齡≥65歲、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、肌肉或骨痛癥狀、堿性磷酸酶升高、高鈣血癥、CD4+T細胞表面PD-1表達率、CD8+T細胞表面PD-1表達率、CD14+單核細胞表面PD-L1表達率為自變量，骨轉移(賦值：0=否，1=是)為因變量，ENTER法篩選變量，最終結果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、高鈣血癥、CD4+T細胞表面PD-1表達率高、CD8+T細胞表面PD-1表達率高、CD14+單核細胞表面PD-L1表達率高是腎細胞癌發生骨轉移的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 腎細胞癌發生骨轉移的多因素Logistic回歸分析

2.4 CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1及CD14+單核細胞表面PD-L1表達診斷腎細胞癌骨轉移的價值 CD4+T 、CD8+T細胞表面PD-1及CD14+單核細胞表面PD-L1表達診斷腎細胞癌骨轉移的曲線下面積分別為0.722、0.721、0.718，三者聯合診斷腎細胞癌骨轉移的曲線下面積為0.915，高于各自單獨診斷效能(Z=5.458、5.094、5.022，P均<0.001)，見表4、圖2。

圖2 CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1及CD14+單核細胞表面PD-L1表達診斷腎細胞癌骨轉移的ROC圖

表4 CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1及CD14+單核細胞表面PD-L1表達診斷腎細胞癌骨轉移的效能

3 討 論

骨是腎細胞癌血源性腫瘤細胞擴散的主要部位，一旦發生骨轉移，治療難度將大幅增加，并可引起嚴重的骨痛、脊髓壓迫、病理性骨折和高鈣血癥，降低患者生存率[7]。免疫檢查點分子是共刺激受體，與配體結合后負向調節效應免疫細胞，積極參與感染的免疫防御、自身免疫的預防、移植和腫瘤免疫逃避[8]。腫瘤免疫逃逸是造成腫瘤轉移的關鍵原因，免疫逃逸可促使上皮間質轉化，導致腫瘤細胞失去細胞間黏附和基底膜黏附力，獲得侵入基底膜和血管及向遠處遷移的能力[9-10]。PD-1是適應性和先天免疫反應的抑制劑，在腫瘤特異性T細胞上高度表達，PD-1與其配體PD-L1結合后產生強烈的抑制信號，下調T細胞活性，控制腫瘤微環境中免疫耐受的誘導和維持，導致抗腫瘤免疫反應退化，促使腫瘤發生及腫瘤進展[11-12]。現有報道顯示，PD-1/PD-L1軸可通過磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路促使癌細胞增殖，還可通過調控絲裂原活化蛋白激酶信號通路調節癌細胞增殖、分化、侵襲和轉移[13]。PD-1/PD-L1被證實與胃癌遠處轉移、三陰性乳腺癌淋巴結轉移、前列腺癌骨轉移有關[14-15]。但是PD-1、PD-L1與腎細胞癌骨轉移的報道十分少見。

本研究發現，外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞表面PD-1表達率及CD14+單核細胞表面PD-L1表達率增高是腎細胞癌骨轉移的危險因素，表明PD-1、PD-L1表達增高可能與腎細胞癌骨轉移有關，可作為骨轉移的潛在標志物。腎細胞癌多因溶骨性病變發生骨轉移，溶骨性轉移是由于骨吸收細胞活性增強所致[16]。骨髓是巨噬細胞、樹突狀細胞、T 細胞亞群等免疫細胞的儲存庫，直接調控免疫細胞增殖和分化，免疫細胞也可直接作用于骨細胞，調節骨細胞發育和骨代謝，腫瘤微環境中免疫細胞抑制可加劇骨—腫瘤微環境[17]。骨髓微環境同時為循環癌細胞歸巢、存活和增殖提供肥沃的土壤，當癌細胞到達骨微環境時，誘導釋放各種因子，如骨形態發生蛋白、轉化生長因子-β、胰島素樣生長因子和成纖維細胞生長因子及其他刺激轉移性腫瘤細胞生長的物質，嵌入骨基質中并導致成骨/破骨系統失衡[16]。因此，推測PD-1、PD-L1可能通過抑制T細胞、B 細胞、自然殺傷細胞、單核細胞活性抑制機體抗腫瘤免疫反應，破壞骨—腫瘤微環境，促使腫瘤細胞免疫逃逸，轉移至骨骼組織，發生溶骨性轉移。

本研究ROC分析結果顯示，PD-1、PD-L1診斷腎細胞癌骨轉移均具有一定價值，聯合診斷骨轉移的效能明顯提高，可為臨床腎細胞癌骨轉移判斷提供可靠的信息，對臨床進一步治療具有指導價值。本研究回歸分析結果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、高鈣血癥與腎細胞癌骨轉移也有關，提示臨床對TNM分期晚期、伴高鈣血癥患者應警惕骨轉移風險。

綜上，腎細胞癌骨轉移患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞表面PD-1表達率及CD14+單核細胞表面PD-L1表達率均增高，且其增高與腎細胞癌骨轉移發生有關，可作為骨轉移診斷的潛在指標。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

朱云：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；吳東娟：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;馬帥軍：資料搜集整理，論文修改;張夢姣：課題設計，進行統計學分析