尼可地爾通過NLRP3/Caspase-1通路對(duì)糖尿病心肌病大鼠心臟損傷的影響

王攀，彭菊琴，陳瀟瀟，劉哲，高云霄，劉建勛，任鈞國

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)為糖尿病心血管并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中炎性反應(yīng)與其關(guān)系密切。高血糖可誘導(dǎo)多種炎性因子生成與釋放，如核因子-κB和炎性小體[1-2]。據(jù)報(bào)道，高血糖會(huì)激活NLRP3炎性小體，從而促進(jìn)pro-Caspase-1裂解為Caspase-1，裂解的Caspase-1一方面將白介素-1β前體(pro-interleukin-1β，pro-IL-1β)和白介素-18前體(pro-interleukin-18，pro-IL-18)轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β和IL-18[3]；另一方面切割消皮素D(GSDMD)的N端序列，促使大量成熟的IL-1β、IL-18釋放到胞外，募集炎性細(xì)胞，擴(kuò)大炎性反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞焦亡[4-5]。此外，炎性小體的激活和細(xì)胞因子的釋放可促進(jìn)膠原蛋白沉積和纖維化形成，進(jìn)一步加劇DCM的嚴(yán)重程度[6]。因此尋找針對(duì)心肌細(xì)胞焦亡的有效藥物，可以緩解DCM的進(jìn)程。尼可地爾是一種已被確認(rèn)具有臨床意義的抗心絞痛藥物，通過促進(jìn)NO的釋放和KATP通道開放引起血管舒張，增加冠狀動(dòng)脈血流量，減少血管痙攣，改善心功能[7-9]。最近的研究表明，尼可地爾可通過抑制心肌梗死大鼠細(xì)胞焦亡來減輕心肌損傷[10]，但其是否能減輕DCM心肌細(xì)胞焦亡尚未見報(bào)道。現(xiàn)探討尼可地爾對(duì)DCM大鼠心功能的保護(hù)作用及潛在的分子機(jī)制，為DCM的治療提供更多的科學(xué)依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物：健康雄性Wistar大鼠，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào) SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度 20～26℃，濕度 40%～70%，明暗12 h交替，自由攝食攝水。(2)藥物及試劑：尼可地爾片(中外制藥株式會(huì)社)，鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，檸檬酸、檸檬酸鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，大鼠IL-1β、IL-18檢測(cè)試劑盒(FANKEW公司)，Anti-NLRP3 抗體、Anti-Caspase-1 抗體、Anti-GSDMD 抗體(abcam公司)，羊抗兔IgG H&L抗體(Bioss公司)，RIPA蛋白裂解液、脫脂奶粉(雅酶公司)，BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所公司)，PMSF、ECL Plus超敏發(fā)光液(Solarbio公司)。(3)儀器設(shè)備：高分辨率小動(dòng)物超聲儀(加拿大VisualSonics公司，型號(hào)Vevo 2100)，高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司，型號(hào)IEC CL31R)，酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司，型號(hào)352)，超聲破碎儀(美國Sonics公司，型號(hào)VCX130)，化學(xué)發(fā)光儀(六一電器公司，型號(hào)WD-9423C)，奧林帕斯顯微鏡(日本奧林帕斯公司，型號(hào)BX51)。

1.2 造模與分組 2020年10月—2021年1月在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021XLC001-2)。24只健康Wistar大鼠隨機(jī)選取8只常規(guī)飼料喂養(yǎng)(正常組)；余16只給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)(高糖高脂飼料：蔗糖10 % 、豬油10 %、膽固醇2.5 %、膽酸鈉1 % 、普通飼料76.5 %)，6周后，禁食不禁水10 h，腹腔注射STZ 30 mg/kg (用pH 4.2～4.5的枸櫞酸緩沖溶液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)，正常組注射同體積的枸櫞酸緩沖溶液；注射 STZ 72 h后尾靜脈采血測(cè)血糖，以空腹血糖≥16.7 mmo/L的大鼠為糖尿病模型復(fù)制成功，16只成模大鼠隨機(jī)分為模型組8只、尼可地爾組(5 mg/kg)8只，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)，4周后開始給藥，照尼可地爾組按照1 ml/100 g灌胃給藥，正常組、模型組給予同體積的蒸餾水，每天灌胃1次，連續(xù)4周，第14周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 心功能測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠采用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，胸部剃毛，仰臥位固定。當(dāng)大鼠心率穩(wěn)定時(shí)開始檢測(cè)，以高頻探頭定位，在左心室長軸及胸骨旁短軸各切面應(yīng)用M模式超聲心動(dòng)圖觀察心臟運(yùn)動(dòng)，選用左心室長軸切面計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、每搏輸出量(stroke volume，SV)，各項(xiàng)指標(biāo)均選取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量值的平均值。

1.3.2 心肌組織形態(tài)學(xué)觀察：每組隨機(jī)選6只大鼠取心臟, 用預(yù)冷的等滲生理鹽水洗凈血跡，濾紙吸干，各取1塊約3 mm3大小的左心室組織置于10% 中性福爾馬林中固定，石蠟包埋，切片(4 μm)，HE染色，脫水封片，顯微鏡下觀察小鼠心肌組織的形態(tài)改變。

1.3.3 心肌纖維化程度測(cè)定：每組取6個(gè)石蠟包埋好的心肌組織切片(4 μm)，經(jīng)Masson染色，脫水封片。顯微鏡下觀察小鼠心肌纖維化變化。采用圖像分析軟件Image-J 1.51統(tǒng)計(jì)膠原容積分?jǐn)?shù)，膠原容積分?jǐn)?shù)(%)=膠原陽性的藍(lán)色面積/視野總面積×100%。

1.3.4 心肌組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)測(cè)定：每組隨機(jī)選3只大鼠各取左心室組織約50 mg置于冷凍管中，-80℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)取出樣本，冰上解凍后，加 RIPA裂解液(含PMSF)提取總蛋白，4℃，用超聲破碎儀破碎組織，離心吸取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量。然后制膠(10%分離膠，5 %濃縮膠)、上樣(每樣品孔上樣30 μg總蛋白)、電泳、轉(zhuǎn)膜、5 %脫脂奶粉封閉(室溫輕搖60 min)，5 %牛奶-TBST稀釋一抗NLRP3、Caspase-1、GAPDH(1∶1 000，室溫孵育15 min)，4℃搖床過夜。第二天5 %牛奶-TBST稀釋二抗(1∶1 000，室溫輕搖60 min)，TBST洗膜，ECL曝光并用化學(xué)發(fā)光儀拍攝照片。運(yùn)用Image J 1.51軟件分析條帶，以目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 心肌組織GSDMD蛋白表達(dá)測(cè)定：每組取6個(gè)石蠟包埋好的心肌組織切片(4 μm)，乙醇梯度脫蠟，抗原修復(fù)，10%BSA室溫封閉1 h，滴加PBS稀釋好的一抗GSDMD(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染30 s，流水沖洗5 min，脫水封片，顯微鏡下觀察并拍照，GSDMD蛋白陽性表達(dá)為棕色。采用Image J 1.51軟件計(jì)算GSDMD蛋白表達(dá)的積分光密度值(IOD)，用IOD表示GSDMD蛋白的表達(dá)水平。

1.3.6 血清IL-1β、IL-18水平測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h后離心取上清，采用ELISA法檢測(cè)血清IL-1β、IL-18水平，具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能比較 與正常組比較，模型組大鼠LVEF、FS、SV均降低(P<0.05)；與模型組比較，尼可地爾組大鼠LVEF、SV均升高(P<0.05)，F(xiàn)S差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心功能比較

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠心肌結(jié)構(gòu)完整，肌纖維排列整齊，形態(tài)正常，間質(zhì)未見充血、出血，未見明顯炎細(xì)胞浸潤；模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，肌間隔增寬，灶性水腫變性，間質(zhì)充血、出血，中等量炎細(xì)胞浸潤；尼可地爾組大鼠心肌纖維排列較規(guī)整，纖維束間隔增寬不明顯，心肌細(xì)胞水腫變性偶見，間質(zhì)輕度充血、水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)比較(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠心肌纖維化程度比較 正常組大鼠心肌纖維束排列整齊，無膠原纖維沉積；模型組大鼠心肌纖維束排列不規(guī)則，且存在大量膠原纖維沉積；尼可地爾組大鼠心肌纖維束排列明顯改善，膠原纖維沉積顯著降低，心肌纖維化明顯減輕，見圖2。與正常組(12.83±3.97)%比較，模型組膠原容積分?jǐn)?shù)(30.00±7.62)%升高(t/P=4.896/0.001)；與模型組比較，尼可地爾組膠原容積分?jǐn)?shù)(21.67±5.57)%降低(t/P=2.163/0.036)。

圖2 各組大鼠心肌纖維化程度比較(Masson染色，×200)

2.4 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，尼可地爾組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1 、GSDMD蛋白表達(dá)水平比較

2.5 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18水平升高(P<0.01)；與模型組比較，尼可地爾組大鼠血清IL-1β、IL-18水平降低(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18水平比較

3 討 論

DCM為糖尿病心血管并發(fā)癥，其特征是在沒有高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病和其他心臟病情況下的結(jié)構(gòu)異常和功能障礙，主要體現(xiàn)在心肌纖維化、心肌肥厚、舒張功能或收縮功能障礙等[11-12]。目前，DCM是糖尿病所有并發(fā)癥中死亡的主要原因[13]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未明確。本研究采用高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射STZ的方法建立DCM大鼠模型，通過焦亡相關(guān)信號(hào)通路NLRP3/Caspase-1來探討尼可地爾對(duì)DCM大鼠心功能的影響及潛在機(jī)制。本結(jié)果顯示，模型組大鼠表現(xiàn)出心肌細(xì)胞水腫、心肌纖維化明顯及心功能低下特點(diǎn)，符合DCM的主要特征，并與文獻(xiàn)中DCM大鼠模型(模型建立方法與本研究相同)的表現(xiàn)一致[14-15]，提示該模型建立成功。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，尼可地爾對(duì)DCM有重要的保護(hù)作用，可通過抑制DCM心臟纖維化和凋亡直接緩解心臟重構(gòu)，改善心功能，此外還能促進(jìn)eNOS活性，釋放NO，其機(jī)制與激活PI3K/Akt通路有關(guān)。

本研究中，給予尼可地爾后，DCM大鼠心肌細(xì)胞水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤面積、心肌纖維化面積減少，且心功能(LVEF、SV)明顯升高，提示尼可地爾有效改善了DCM大鼠的心肌重構(gòu)及心功能。

DCM期間心肌細(xì)胞的終末途徑是細(xì)胞死亡，因此抑制細(xì)胞死亡信號(hào)通路顯然是DCM的潛在治療靶點(diǎn)。在形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞死亡可分為4種不同的形式，包括凋亡、自噬、壞死和吞并。此外，還存在一些其他類型的細(xì)胞死亡，如鐵死亡、溶酶體依賴性細(xì)胞死亡等，這些可能都與DCM相關(guān)[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，焦亡是程序性壞死的一種新形式，與細(xì)胞凋亡不同，其本質(zhì)是細(xì)胞的炎性反應(yīng)性死亡，是心肌細(xì)胞丟失的機(jī)制之一[18]。細(xì)胞焦亡的特征是孔隙形成、質(zhì)膜破裂和細(xì)胞腫脹[19]。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞焦亡參與了DCM的發(fā)展[20-21]，在高糖刺激下，炎性小體NLRP3激活，進(jìn)而促進(jìn)pro-Caspase-1裂解，裂解的Caspase-1一方面促進(jìn)炎性因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β和IL-18，另一方面切割GSDMD的N端序列，促進(jìn)細(xì)胞裂解，釋放大量成熟的IL-1β、IL-18，誘發(fā)細(xì)胞焦亡[3-5]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組，且血清IL-1β、IL-18也明顯高于正常組，再次證實(shí)與炎性反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞焦亡參與了糖尿病誘導(dǎo)心臟損傷的發(fā)病機(jī)制[20-21]。尼可地爾作為常用的抗心絞痛藥物，可以對(duì)冠狀動(dòng)脈產(chǎn)生積極的擴(kuò)張作用、增加血流量、抑制冠狀動(dòng)脈痙攣，減輕心絞痛，還能對(duì)部分瀕死的心肌進(jìn)行挽救，降低心血管事件的發(fā)生[8-9]，但其是否能通過抑制DCM細(xì)胞焦亡來減輕心臟損傷尚未報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，給予尼可地爾干預(yù)后，DCM大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平明顯降低，且血清中IL-1β、IL-18水平也明顯降低，提示尼可地爾可能通過抑制焦亡信號(hào)通路NLRP3/Caspase-1來減輕DCM心臟損傷。

綜上所述，尼可地爾可能通過抑制焦亡相關(guān)信號(hào)通路NLRP3/Caspase-1來抑制炎性因子的釋放，進(jìn)而抑制心肌重構(gòu)和心肌纖維化，改善心功能。本研究為豐富DCM細(xì)胞死亡的研究及未來DCM新的療法奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王攀：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫及修改；彭菊琴、陳瀟瀟、劉哲：實(shí)施研究過程，資料搜集整理；高云霄：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；劉建勛：論文修改；任鈞國：設(shè)計(jì)研究方案，提出研究思路，論文審核