植物免疫誘抗劑對烤煙青枯病的誘導抗性及防控效果

韋學平， 蘇江華， 羅 剛， 周文亮， 顧云峰， 王俊鋒

(廣西壯族自治區煙草公司 百色市公司， 廣西 百色 533000)

0 引言

【研究意義】煙草青枯病俗稱煙瘟、半邊瘋，是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種細菌性維管束病害，該病屬于典型的土傳病害。病菌主要從根部侵入木質部維管束組織并大量繁殖，發病后，易造成全株萎蔫和死亡，對煙草的產量和質量影響很大，是煙草生產過程中的主要限制因子之一[1-4]。煙草青枯病的有效防控十分困難，采用殺菌劑防治青枯病的效果尚不十分理想，生物防治效果不夠穩定，而農業防治措施不易實施到位。因此，尋求有效的煙草青枯病防治措施一直受到研究者的關注。植物系統獲得抗性(Systemic Acquired Resistance，SAR)是指利用物理、化學或者生物因子，誘導植物抗性基因的表達，促使防衛反應產物積累，從而提高自身抗病能力。在此誘導過程中，涉及一系列防衛反應相關酶及基因的激活、信號傳輸及植物組織抗病相關生理生化的變化[5]。開展誘導煙草主動產生抵御病蟲害的抗性能力及其他抗逆能力，提高產量及品質的研究，是促進煙草生產可持續發展的新起點和防治煙草病害的新思路。【前人研究進展】關于植物誘導抗病性的研究工作始于20世紀50年代，因其具有抗性持久穩定、廣譜、無污染等特點，使得開發誘抗劑成為目前有害生物綠色防控技術研究的熱點之一。已有研究報道表明[6-10]，水楊酸(Salicylic acid，SA)、苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)、β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid，BABA)、2,6-二氯異煙酸(2,6-dichloroisonicotinic acid，INA)、噻菌林(Probenazole，PBZ)及茉莉酸(Jasmonic acid，JA)等可誘導煙草對多種病原物產生抗性，且某些化學誘抗劑已用于煙葉生產。一些非致病菌或從生物體提取的物質，如殼聚糖(Chitosan)、寡糖素(Oligosaccharin)、糖蛋白(Glycoprotein)和Harpin類蛋白，會引發組織內多種防御性酶的活性提高，從而誘導產生抗病性[11]。陳澤鵬等[12]研究表明，苯并噻二唑(BTH)對煙草誘導抗病具有顯著效果，濃度50 μg/mL處理，離體和活體誘導抗病率分別為60.96%和52.76%。趙小明等[13]利用氨基寡糖素防治煙草、辣椒及番茄等作物病毒病，其對煙草病毒病的防效達77.9%。王志愿[14]研究發現，誘抗劑殼聚糖(CTS)對煙草青枯病的防控效果達81.17%。韓松庭等[15]研究發現，2,6-二氯異煙酸與多粘類芽孢桿菌聯用對青枯病的防控效果達50%以上，顯著高于其他處理。【研究切入點】目前，防治煙草青枯病的主要辦法有化學防治、生物防治、農業防治和選用抗病品種等，但仍以化學防治為主。而化學藥劑不僅易使青枯病菌產生耐藥性，對土壤和水體等均有嚴重危害。因此，具有無污染、不易產生抗性、對人畜安全等優點的生物防治已成為防治青枯病的研究熱點。植物誘導抗病性具有廣譜、抗性持久且穩定、無污染等特點，利用植物天然免疫系統防治病蟲害，可減少農藥的使用，降低農殘，提高產品安全性，更符合當今煙草綠色防控發展理念的要求。【擬解決的關鍵問題】對不同來源的植物免疫誘抗劑噻菌銅、多肽保、綠色木霉菌、青枯立克、奇農素、氨基酸酶及乙蒜素等20種誘抗劑及其不同組合開展抗性測定，篩選對煙草青枯病有顯著防治效果的誘抗劑及組合，以期為煙草病害綠色防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌 煙草青枯病病原菌從采自廣西靖西市的煙草青枯病標本中分離獲得。

1.1.2 烤煙 供試煙草品種為云煙87，由云南省煙草農業科學研究院提供。

1.1.3 試劑 NA培養基(瓊脂粉15 g，蔗糖15 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 000 mL)，自制；水楊酸、茉莉酸、苯丙咪二唑類、苯并噻重氮、苯并噻唑、2,6-二氯異煙酸、氨基酸酶、多肽保、綠色木霉、噻菌銅、奇農素、殼聚糖、過敏素蛋白、青枯立克、黃腐酸、腐殖酸、乙蒜素、寡糖素、天冬氨酸及有機硅(市購)。

1.1.4 儀器設備 SP-754紫外分光光度計(上海Thermo有限公司)，臺式高速冷凍離心機(BecKman公司)，BS 223S型精密電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，數顯恒溫水浴鍋(JULABO德國)及250D光照培養箱(常州國華電器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 煙草青枯病病原菌的分離培養 使用平板劃線分離法進行病原菌分離。將標本病莖用清水沖洗干凈，縱剖，切取褐變的維管束組織，用75%酒精表面消毒30 s，0.1%升汞溶液消毒1 min，之后用無菌水漂洗3次。磨碎組織加無菌水稀釋，用滅菌移植環沾取含菌液體在NA培養基上劃線培養。之后挑取青枯菌的單菌落，加無菌水稀釋，轉接于NA培養基上純化培養，最后移入滅菌水中保存備用。

1.2.2 誘抗劑對煙草青枯病的防控 云煙87采用盤栽，移栽時間為3月15日，移栽當天第1次施藥，之后每10 d施用1次，每次施200 mL，共施用3次。每個處理50株煙，3次重復，小區隨機排列。在第1次施藥后7 d，采用傷根接種青枯病原菌。第3次施用后15 d調查病情指數，每處理調查50株，計算防治效果。

1) 單一誘抗劑。試驗設21個處理，分別按水楊酸、茉莉酸、苯丙咪二唑類、苯并噻重氮、苯并噻唑、2,6-二氯異煙酸、氨基酸酶、多肽保、綠色木霉菌、噻菌銅、奇農素、殼聚糖、過敏素蛋白、青枯立克、黃腐酸、腐殖酸、乙蒜素、寡糖素、天冬氨酸及有機硅的常規使用濃度進行試驗，以清水作對照(CK)。

2) 不同誘抗劑組合。試驗設6個處理：T1，氨基酸酶(500倍)；T2，多肽保(60倍)+綠色木霉菌(6 000倍)；T3，氨基酸酶(500倍)+噻菌銅(500倍)+奇農素(750倍噴濕葉面)；T4，氨基酸酶(500倍)+多肽保(60倍)+綠色木霉菌(6 000倍)；T5，氨基酸酶(500倍)+多肽保(60倍)+青枯立克(500倍)+乙蒜素(500倍)；T6，對照(CK)，常規施肥。

1.2.3 誘抗劑對煙草抗青枯病的誘導 按誘抗劑對青枯病防控的組合處理(T1～T6)進行試驗，常規管理。灌根處理，每次施200 mL，每小區200株，3次重復。在施藥后7 d，采用傷根接種青枯病原菌，分別于CK明顯發病后1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d及14 d，參考賈春燕[16]的方法進行粗酶液的提取和SOD、POD及CAT活性測定。

1.2.4 田間誘導抗病試驗 按誘抗劑對青枯病防控的組合處理(T1～T6)試驗進行，常規施肥。試驗于2017—2018年在廣西壯族自治區靖西市新甲鄉新榮村長期種植煙草的田塊進行大田試驗，云煙87移栽時間為2月25日，試驗地泥土為壤土，周邊大山環繞，煙草青枯病常年大面積發生。移栽當天第1次施藥，之后每10 d施1次，共施3次，每次施200 mL。3次重復，小區面積130 m2，小區隨機排列。于5月15日進行病情調查，每處理調查100株。煙草病害嚴重度分級標準采用煙草病蟲害分級及調查方法：GB/T 23222—2008[17]進行分級，計算誘抗效果。

病情指數=∑[(各級病株數×級數值)/(調查總株數×最高級數值)]×100

防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100%

1.3 數據統計與分析

通過Excel 2010錄入數據并作圖，使用SPSS的Duncan法檢測及進行差異顯著性檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 不同誘抗劑對煙草青枯病的室內誘導抗性

2.1.1 單劑 從表1看出，第3次施藥后15 d，噻菌銅、多肽保、綠色木霉菌、青枯立克及奇農素等20種誘抗劑對煙草青枯病均有不同程度的抑制作用，各誘抗劑處理的病情指數為19.56～35.33，均低于CK(37.33)；防治效果為5.36%～47.02%，其中，噻菌銅、多肽保、綠色木霉菌、青枯立克、奇農素、氨基酸酶和乙蒜素的防治效果相對其余藥劑較好，使用后烤煙青枯病病情指數明顯下降，均低于23.00，對煙草青枯病防治效果分別為47.02%、45.83%、44.64%、43.45%、41.67%、39.88%和39.29%。表明，7種誘抗劑對煙草青枯病的發生均具有一定的防治效果，后續進一步對7種誘抗劑進行不同組合抗性測定。

表1 不同誘抗劑處理后煙草青枯病的病情指數及防治效果

2.1.2 組合劑 從表2看出，誘抗劑處理煙草青枯病的病情指數為11.11～18.67，防治效果為42.86%～65.99%，不同藥劑組合處理均較氨基酸酶(單劑)和CK有不同程度提高。其中，T2、T4和T5對煙草青枯病防治效果較好，其病情指數相對較低，依次為16.67、13.33和11.11，防效分別為48.98%、59.18%和65.99%。

表2 不同處理煙草青枯病的病情指數及防治效果

2.2 不同處理煙草葉片的酶活性

從圖1看出6個處理煙草葉片的SOD、POD及CAT活性變化。

圖1 不同處理煙草葉片的SOD、POD及CAT活性

2.2.1 SOD活性 6個處理各時段煙草葉片的SOD活性均呈T5>T4>T2>T1>T3>T6(CK)，且隨時間延長，各處理SOD活性基本呈上升趨勢，第10天達峰值，而后開始平穩下降。其中，T5的SOD活性在各時段均最高，T4其次，T2第3，表明3個處理的誘導抗性較好。

2.2.2 POD活性 6個處理各時段煙草葉片的POD活性均呈T5>T4>B>T1>T3>T6(CK)，且隨時間延長，均發生明顯變化，呈先升后降趨勢，均在第10天達峰值。其中，T5的POD活性在各時段均最高，T4其次，T2第3，表明3個處理在受到病原菌侵染時均可誘導煙草提高對青枯病的抗性；T1和T3的煙葉POD活性變化較平穩，不具有明顯的誘導效果，但也略高于T6(CK)。

2.2.3 CAT活性 6個處理各時段煙草葉片的CAT活性均呈T5>T4>T2>T1>T3>T6(CK)，且隨時間延長，T5、T4和T2均發生明顯變化，呈先升后降再升趨勢。其中，T5、T4和T2煙葉的CAT活性明顯高于T3、T1和T6，各處理CAT活性在第8天達高峰，T5的CAT活性變化最大，T6的變化最小。表明，T5、T4和T2均可誘導煙草提高對青枯病的抗性。

2.3 田間防治效果

從表3看出，2017年和2018年6個處理煙草的發病率、病情指數及防治效果變化。

表3 不同處理對煙草青枯病的田間防治效果

2.3.1 發病率 2017年和2018年誘抗劑處理煙草田間青枯病的發病率分別為5%～11%和6%～12%，均低于CK(12%和14%)，均表現為T5

2.3.2 病情指數 2017年和2018年誘抗劑處理煙草田間青枯病的病情指數分別為4.67～9.56和6.67～10.00，2年均低于CK(13.78和15.78)，均表現為T5

2.3.3 防治效果 2017年和2018年誘抗劑處理煙草田間青枯病的防治效果分別為30.65%～66.13%和36.62%～57.75%，2年試驗結果基本一致，表現為T5>T4>T2>T1>T3。T4和T5對煙草青枯病的防治效果較好，2017年、2018年分別達56.45%、66.13%和49.30%、57.75%。T3對煙草青枯病的防治效果不理想。

3 討論

植物抗性誘導物質作為一種新型的生物制劑，不僅能有效防治病蟲害，還能提高作物產量，對植物的抗逆功能也有提高作用，因此在煙草病害的綜合防治中越來越受到重視。黃夸克等[18]研究報道，大田期使用誘導抗病劑“多肽保”后，對煙草黑脛病的相對防治效果平均達75.0%，對煙草根黑腐病的相對防治效果平均達75.9%。何永福等[19]發現，多肽保能夠顯著提高反季節白菜的產量，并對霜霉病有一定的防治效果。端永明等[20]研究報道，煙草大田期噴施2.50 g/L綠色木霉菌對黑脛病的最高防效為81.3%，對野火病的最高防效為80.0%。韋文添[21]研究報道，80%乙蒜素對油梨炭疽病菌有很好的防治效果。研究結果表明，噻菌銅、多肽保、綠色木霉菌、青枯立克和奇農素等20種誘抗劑對煙草青枯病均有一定的抑制作用，其中，噻菌銅、多肽保、綠色木霉菌、青枯立克、奇農素、氨基酸酶和乙蒜素的作用較好，使用后烤煙青枯病病情指數明顯下降，對煙草青枯病防治效果分別為47.02%、45.83%、44.64%、43.45%、41.67%、39.88%和39.29%。以上幾種誘抗劑對煙草青枯病的發生均具有一定的防治效果。氨基酸酶(T1)、多肽保+綠色木霉菌(T2)、氨基酸酶+噻菌銅+奇農素(T3)、氨基酸酶+多肽保+綠色木霉菌(T4)和氨基酸酶+多肽保+青枯立克+乙蒜素(T5)等不同組合處理對煙草青枯病有明顯防治效果。2017年和2018年各組合處理對煙草青枯病的田間防治效果基本一致，均表現為T5>T4>T2>T1>T3。T5和T4對煙草青枯病的防治效果比較好，2017年和2018年分別達56.45%、66.13%和49.30%、57.75%。氨基酸酶、多肽保、綠色木霉菌、青枯立克等誘抗劑及其不同組合對誘導煙草提高抗病性具有較好的效果。研究結果表明，氨基酸酶、多肽保、綠色木霉菌、乙蒜素等誘抗劑及不同組合對煙草等作物有較好的防治效果，與劉太國等[6-7,12]的研究結果基本一致。

4 結論

氨基酸酶(500倍)+多肽保(60倍)+綠色木霉菌(6 000倍)和氨基酸酶(500倍)+多肽保(60倍)+青枯立克(500倍)+乙蒜素(500倍)處理能較好地誘導煙草抗青枯病，防治效果明顯，可作為煙區防治煙草青枯病的新方法。