栽培草莓小孢子細胞學發育時期與花器形態的相關性

馬紅葉， 王愛華， 李榮飛， 楊仕品*， 黃 偉， 喬 榮， 鐘霈霖

(1.貴州省園藝研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農業科學院 山茂園藝工程技術中心， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】小孢子培養是指從花蕾中游離出小孢子后，經過誘導培養，改變其配子體發育途徑為孢子體途徑，通過胚狀體或愈傷組織方式成長為完整植株的方法，是植物單倍體育種的重要技術手段[1]。培養出的單倍體植株再經過染色體加倍形成二倍體或多單倍體，可達到快速獲得純合子，暴露或消除遺傳有害基因，簡化遺傳系統，提高育種效率的目的[2]。草莓為高度雜合多倍體植物(栽培種草莓多為8倍體)，傳統育種手段很難在抗性等方面獲得突破，利用小孢子培養誘導產生胚狀體獲得純合基因型株系，對草莓育種及遺傳分析具有重要意義[3]。【前人研究進展】小孢子培養成功與否受小孢子發育時期[1]、基因型[4]、植株生理狀態[5]、預處理[6]、培養基[7]和培養條件[8]等因素影響，其中小孢子發育時期是決定小孢子能否誘導成功的關鍵[1]。過早，小孢子發育不成熟，對外界適應能力差，不易存活；過晚，小孢子發育途徑不可逆轉，脫分化失敗，不能形成胚狀體[9]。HAUSE等[1]研究發現，單核靠邊期(單核晚期)是小孢子培養的最佳時期，此期的小孢子對激素刺激和培養條件最為敏感，是誘導小孢子由配子體途徑向孢子體途徑轉變的最有效時期。楊延紅等[10-11]認為，雙核早期同樣可成功誘導小孢子，不同植物之間略有差異。通過顯微鏡細胞學觀察可確定小孢子的發育時期，但需檢查每個花藥，費時費力，并會對小孢子活力造成一定的損傷，增加培養過程中的污染率和死亡率[9]。小孢子發育具有不同步性，尤其是草莓，不同花序甚至同一花序的不同花蕾，小孢子發育狀態都存在差異[12]，鏡檢每個花蕾的實際操作并不現實，探尋便捷確定小孢子發育時期的方法具有重要意義。已有研究發現，小白菜[10]、辣椒[13]、黃花菜[14]、甘藍[15]、火龍果[16]和棗[17]等多種植物的小孢子發育時期與花蕾外部形態，如花蕾縱徑和橫徑、花藥長寬及花瓣長等密切相關，可用于判別小孢子的發育時期。【研究切入點】未見栽培草莓小孢子細胞學發育時期與花器形態相關性的研究報道，為此，選擇章姬、紅顏、黔莓1號和黔莓2號4個草莓品種，探究其小孢子6個發育時期花蕾、花瓣、花藥外觀形態及花蕾縱橫徑、主副萼長、花瓣長、花藥長的變化，以判別其小孢子的發育時期。【擬解決的關鍵問題】探明栽培草莓小孢子具有胚發生能力時期的花器形態，為小孢子培養田間準確取樣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

章姬、紅顏、黔莓1號和黔莓2號4個草莓品種均為栽培種，其花蕾均采自貴州省園藝研究所草莓科技示范園。

1.2 方法

試驗于2019年10月至2020年3月在貴州省園藝研究所草莓科技示范園進行。試驗以章姬、紅顏、黔莓1號和黔莓2號4個草莓品種為試材，觀察測定小孢子花粉母細胞時期、四分孢子時期、單核早期、單核中期、單核晚期(單核靠邊期)和雙核期6個發育時期花蕾、花瓣、花藥外觀形態及花蕾縱橫徑、主副萼長、花瓣長和花藥長的變化。觀察記錄花蕾形態，花瓣顏色、透明度及彎曲程度，花藥顏色；采用數顯游標卡尺測量草莓花蕾縱徑、橫徑、花萼長、花瓣長及花藥長度。每個發育時期觀察測量15個花蕾，3次重復。

1.3 數據處理

采用DPS 7.05處理數據，Excel 2010制圖，Duncan法檢驗差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同草莓品種小孢子各發育時期花蕾等的外觀特征

從圖1看出，章姬、紅顏、黔莓1號和黔莓2號4個草莓品種隨著小孢子的不斷發育，其花蕾均表現為體積不斷增大，逐漸飽滿，外觀顏色由黃綠色逐步變為綠色，茸毛變稀變短。花蕾主、副萼由花粉母細胞時期的包裹極緊閉逐步變為雙核期副萼全部展開，主萼松動。從表1可知，黔莓1號小孢子細胞學發育時期與花蕾形態和花瓣的顏色、透明度、彎曲程度及花藥顏色相關。花瓣透明度：從母細胞時期的高透明、綠黃色逐漸發育至雙核期的不透明、白中帶青色，且彎曲程度由低到高再逐漸降低。花藥顏色：在6個不同發育時期顏色變化為綠黃色透明→淡黃綠色半透明→黃綠色不透明→淺黃色不透明→檸檬黃色不透明→黃色不透明。花藥光澤度：從花粉母細胞時期的有光澤發育到單核早期及之后的無光澤，其他3個品種花藥顏色與黔莓1號稍有差異，但不明顯。4個草莓品種在單核晚期，花蕾形態均表現為花蕾膨大飽滿，副萼開張，主萼閉合，看不到花瓣。

注：A，花粉母細胞時期；B，四分孢子時期；C，單核早期；D，單核中期；E，單核晚期；F，雙核期。

表1 黔莓1號小孢子不同發育時期花蕾、花瓣和花藥的外觀特征

2.2 不同草莓品種小孢子各發育時期花蕾的形態特征

2.2.1 章姬 從圖2看出，除主副萼比外，章姬小孢子細胞學不同發育時期花蕾的橫徑、縱徑、主萼長、副萼長、花瓣長和花藥長均隨發育時期的推進而不斷增大，且差異顯著，可根據以上指標斷定小孢子的發育時期。其中，單核晚期花朵的縱、橫徑分別為9.93 mm和7.39 mm；主萼、副萼增長量最大，至雙核期分別增加10.57 mm和10.54 mm；主副萼比變化較小，不同時期為0.93～0.99，各發育時期間差異不顯著；花瓣長增幅最大，雙核期花瓣長度是花粉母細胞時期的12.8倍；花藥長增長量最少，從花粉母細胞時期的0.73 mm增至單核晚期的1.62 mm。

注：不同小寫字母表示不同發育階段花蕾的縱徑、橫徑、主萼長、副萼長、主副萼比、花瓣長和花藥長差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2.2 紅顏 從圖3看出，除主副萼比外，紅顏小孢子細胞學不同發育時期花蕾的橫徑、縱徑、主萼長、副萼長、花瓣長和花藥長均隨發育時期的推進而不斷增大，且差異顯著，可根據以上指標斷定小孢子的發育時期。其中，單核晚期時花朵的橫徑、縱徑分別為9.71 mm和7.39 mm；主萼、副萼長隨著小孢子的不斷發育而逐漸增大，至雙核期均增長10 mm以上；主副萼比變化也較小，不同時期為0.96～1.01，各發育時期間差異不顯著；花瓣長增幅最大，雙核期花瓣長是花粉母細胞時期的12.68倍；花藥長由花粉母細胞時期的0.78 mm增至雙核期的1.78 mm。

圖3 紅顏小孢子不同細胞學發育時期的花蕾特征

2.2.3 黔莓1號 從圖4看出，除主副萼比外，黔莓1號小孢子細胞學不同發育時期花蕾的橫徑、縱徑、主萼長、副萼長、花瓣長和花藥長均隨發育時期的推進而不斷增大，且差異顯著，可根據以上指標斷定小孢子的發育時期。經過6個發育時期，不同時期主副萼比為0.91～1.01，各發育時期間差異不顯著；增長量最大的是主萼和副萼長，雙核期較花粉母細胞時期分別增加9.36 mm和10.86 mm，增速最大的是花瓣長，雙核期是花粉母細胞時期的13.77倍；單核晚期花蕾縱徑、橫徑、主萼長、副萼長、花瓣長和花藥長分別為9.63 mm、6.54 mm、11.75 mm、12.36 mm、5.65 mm和1.38 mm。

圖4 黔莓1號小孢子不同細胞學發育時期的花蕾特征

2.2.4 黔莓2號 從圖5看出，除主副萼比外，黔莓2號小孢子細胞學不同發育時期花蕾的橫徑、縱徑、主萼長、副萼長、花瓣長和花藥長均隨發育時期的推進而不斷增大，且差異顯著，可根據以上指標明確斷定小孢子的發育時期。其中，單核晚期花蕾縱徑和橫徑分別為9.47 mm和6.39 mm，主萼長、副萼長、花瓣長和花藥長分別為11.84 mm、12.55 mm、5.43 mm和1.73 m，不同時期主副萼比為0.93～1.00。

圖5 黔莓2號小孢子不同細胞學發育時期的花蕾特征

2.3 不同草莓品種單核晚期的花蕾特征

從表2可知，單核晚期章姬、紅顏、黔莓1號和黔莓2號4個草莓品種花蕾的橫徑、縱徑和主萼長等的變化。縱徑：不同品種為9.47～9.93 mm，依次為章姬>紅顏>黔莓1號>黔莓2號，各品種間差異不顯著。橫徑：不同品種為6.39～7.39 mm，依次為章姬=紅顏>黔莓1號>黔莓2號，章姬和紅顏顯著大于黔莓1號和黔莓2號，章姬與紅顏間和黔莓1號與黔莓2號間差異不顯著。主萼長：不同品種為10.65～11.85 mm，依次為章姬>黔莓2號>黔莓1號>紅顏，章姬、黔莓2號和黔莓1號間差異不顯著，均顯著長于紅顏。副萼長：不同品種為11.13～12.55 mm，依次為黔莓2號>黔莓1號>章姬>紅顏，黔莓2號顯著長于紅顏，章姬、黔莓1號與紅顏間和黔莓2號、黔莓1號與章姬間差異均不顯著。花瓣長：不同品種為5.00～5.65 mm，依次為黔莓1號>黔莓2號>章姬>紅顏，黔莓1號顯著長于章姬和紅顏，章姬、紅顏與黔莓2號間和黔莓1號與黔莓2號間差異均不顯著。花藥長：不同品種為1.63～1.70 mm，依次為黔莓2號>紅顏>章姬=黔莓1號。

表2 單核晚期4個草莓品種的花蕾特征

3 討論

適宜小孢子發育時期的選擇是成功培養小孢子的關鍵[18]。AIONESEI等[19]研究認為，單核晚期至雙核早期的小孢子容易誘導出胚狀體。不同植物間，適宜培養階段略有不同。LI等[20]通過培養單核晚期的白菜小孢子，成功誘導出胚。李智軍等[21]采用單核晚期芥藍小孢子進行培養，成功獲得150個小孢子再生植株。而TAKAHATA等[22]研究發現，甘藍小孢子培養的最佳時期是單核靠邊期至雙核期。王萌[12]以東北草莓和綠色草莓2個野生草莓單核晚期小孢子為試材，成功誘導出1個球形胚，可暫將單核靠邊期作為草莓小孢子的適宜培養期。

小孢子細胞學發育時期與花蕾形態關系密切，花蕾形態特征可作為小孢子適宜培養階段的取材依據[23]。楊延紅等[10]研究發現，小白菜小孢子單核晚期花蕾縱徑為2.68～3.80 mm，花蕾橫徑1.91～2.19 mm，花瓣長2.70～3.22 mm，花萼長2.15～2.71 mm，花藥長1.76～2.39 mm，可作為小孢子單核晚期的采樣依據。張琨等[14]研究認為，黃花菜花蕾縱徑和花藥長度在小孢子發育的 4個時期均存在極顯著差異，適宜作為判斷黃花菜小孢子發育時期的形態指標。龐強強等[24]研究菜心小孢子發育時期與花器官形態的相關性時發現，單核靠邊期的花器官外觀特征表現為花蕾飽滿，萼片綠色并包被著花冠，花瓣和花藥均為淺黃色，花藥略長于花瓣，可依據花器官形態特征判斷菜心小孢子發育時期。研究結果表明，章姬、紅顏、黔莓1號和黔莓2號4個草莓品種小孢子細胞學發育時期與花蕾形態存在相關性，除主副萼比外，各品種小孢子細胞學不同發育時期花蕾的橫徑、縱徑、主萼長、副萼長、花瓣長和花藥長均隨發育時期的推進而不斷增大，且差異顯著，均可根據以上指標明確小孢子的發育時期。

小孢子單核晚期，4個草莓品種花蕾外觀上均為花蕾膨大、飽滿，副萼開張，主萼閉合，看不到花瓣，花藥檸檬黃色，不透明；花蕾縱徑、花蕾橫徑、主萼長、副萼長、花瓣長和花藥長分別為9.47～9.93 mm、6.39～7.39 mm、10.65～11.85 mm、11.13～12.55 mm、5.00～5.65 mm和1.63～1.70 mm。其中，各品種間花蕾縱徑和花藥長差異不顯著，適宜作為不同草莓材料取樣時期的鑒定指標；其余指標各品種間差異顯著或不顯著，其變化特征可能與品種本身的特性有關。因此，在花蕾橫徑、主萼長、副萼長和花瓣長上很難找到用于選取適宜發育時期花蕾的統一標準。田間采樣時可將花蕾膨大、飽滿，副萼開張，主萼閉合，看不到花瓣，花藥檸檬黃色和花蕾縱徑 9.47～9.93 mm，花藥長1.63～1.70 mm作為判斷小孢子單核晚期發育階段的指標，省去鏡檢的繁瑣步驟，做到精準取樣，提高小孢子培養效率。

4 結論

章姬、紅顏、黔莓1號和黔莓2號4個草莓品種小孢子發育階段與其花器官性狀密切相關，其花蕾縱徑、橫徑、主萼長、副萼長、花瓣長、花藥長均隨小孢子發育不斷顯著增大，可作為各品種細胞發育時期的判斷標準。其中單核晚期的判斷標準為花蕾膨大、飽滿，副萼開張，主萼閉合，看不到花瓣，花藥檸檬黃色，花蕾縱徑和花藥長分別為9.47～9.93 mm和1.63～1.70 mm。