血小板反應蛋白1與老年腦卒中繼發癲癇的炎癥反應及認知損害的相關性研究

王為 趙蒙 李昀 殷宏宇

腦卒中后癲癇(post-stroke epilepsy，PSE)是缺血性腦卒中常見的神經系統并發癥[1]，可嚴重影響病人的神經功能，導致預后不良[2]。外泌體是內皮衍生的胞外囊泡，因其具有良好的結構穩定性和生物學特性，已經成為多種疾病最具潛力的生物標志物之一。Lin等[3]基于蛋白質組學研究，證實血清外泌體蛋白血小板反應蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)在癲癇人群和健康人群中存在差異性表達。TSP-1是轉化生長因子(TGF)的主要活化劑，也是介導炎癥反應的重要因子，可誘導受損組織產生強烈的趨化反應。從生理學上講，局灶性或全身性非調控的炎癥過程可導致神經連接異常和神經元網絡超興奮，從而介導癲癇的發生[4]。本研究旨在分析TSP-1表達變化與PSE發生的相關性，為進一步闡述PSE的發生機制以及尋找臨床生物標志物提供新的循證醫學證據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究屬于單中心、前瞻性隊列研究，選取204例于2018年1月至2019年6月在我院急診就診的老年缺血性腦卒中病人，男130例，女74例，年齡63～89歲，平均(73.59±14.13)歲，發病至入院時間≤7 d；符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[5]中對腦卒中的診斷。PSE定義為腦卒中7 d后有2次自發性癲癇發作或1次癲癇發作加上腦電圖顯示的癲癇樣放電或經頭顱多模式核磁共振(mMRI)顯示的持久相關病變[6]。癲癇持續狀態定義為單次癲癇發作持續超過5 min或者在5 min內連續發生≥2次發作且不能恢復正常意識。納入標準：60～90歲，有明確的缺血性腦卒中病史；符合PSE的診斷標準；臨床資料完整。排除標準：(1)有顱腦外傷史、熱性驚厥痙攣或癲癇史；(2)合并進行性神經系統疾病、經影像學證實存在顱內占位性病變、精神病史；(3)合并自身免疫性疾病、血液系統或其他惡性腫瘤疾病；(4)合并心、肝、腎、血液等系統嚴重功能障礙。所有病人及家屬均對本研究知情且簽署知情同意書，本研究方案經倫理委員會及機構審查委員會審批備案，所有研究人員均遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2 基線數據和樣本采集 收集研究對象的一般資料，包括腦卒中病史、血管疾病的危險因素(如高血壓、糖尿病、心室顫動、高脂血癥、冠狀動脈疾病、吸煙和腦卒中史)、病因、腦電圖、影像學和臨床實驗室檢測結果，包括估算的腎小球濾過率(eGFR)、Hb、血清肌酐(sCr)、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C以及血清炎癥因子IL-6、TNF-α、轉化生長因子-β1(TGF-β1)水平。在病人入院時和確診PSE時采集外周靜脈血，分離并提純血清外泌體后，保存在-80 ℃。收集病人的NIHSS評分，病灶部位及病灶數。

1.3 隨訪 對所有病人出院后進行為期2年的隨訪觀察，在出院時以及隨訪結束時由同一組接受過專業培訓的研究人員采用MMSE評價認知功能，計算MMSE差值(MMSE差值=隨訪2年后MMSE評分-出院時MMSE評分)，當差值為負數時認為病人出現了認知損害。

1.4 研究方法

1.4.1 血清外泌體的獲取及鑒定：所有病人入組當天采集外周靜脈血15 mL置于離心管中，室溫下靜置30 min，待血液凝固后使用離心機3000 r/min離心10 min，獲取上清液并置于-80 ℃冰箱中儲存待測。使用外泌體分離試劑盒(Invitrogen Life Technologies公司，美國)按說明書方法以10 000 r/min超速離心30 min，去除細胞及碎片后，將外泌體分離試劑與收集的上清液充分混合，并在4℃環境下孵育30 min。之后，在室溫下以100 000 r/min二次離心5 min，收集管底沉淀外泌體，再次120 000 r/min離心30 s除去沉淀中多余液體，然后用磷酸鹽緩沖液重懸。用透射電鏡觀察顆粒結構和分布。采用流式細胞術檢測外泌體標記物CD9、CD63、CD81、CD31、Rab5b表達。

1.4.2 Western blot法檢測外泌體TSP-1蛋白表達：采用RIPA蛋白質提取試劑盒(碧云天生物技術公司，中國)提取外泌體中的蛋白質，使用增強型蛋白質測定試劑盒(Thermo Scientific公司，美國)測定蛋白質濃度，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，然后半干法將目標蛋白條帶轉移到聚偏二氟乙烯膜上，將該膜與TSP-1(1：2000)、GAPDH(1：5000)一抗分別孵育過夜，與二抗孵育60 min。通過電化學發光法及Image J軟件進行分析。

1.4.3 ELISA檢測血清外泌體TSP-1蛋白水平：將提取的血清外泌體總蛋白，進一步使用MK3酶標儀(Thermo Scientific公司，美國)和TSP-1 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)進行檢測。在酶標板上每孔加入100μL樣品或標準品，37℃孵育10 min，加入100μL濃縮生物素化Ab，37℃孵育60 min，洗滌3次。然后將100μL抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物加入至每個孔中，37 ℃反應30 min。加入四甲基聯苯胺37 ℃避光孵育15 min，終止反應后，讀取450 nm處的光密度值(OD)。

2 結果

2.1 血清外泌體提取和鑒定 經透射電鏡觀察，可見圓形或橢圓形、茶托狀、雙膜囊泡狀結構，直徑為30～150 nm，粒子濃度約為(4.44±0.34)×108/mL。經流式細胞術檢測，在分離的外泌體顆粒樣本中出現外泌體CD9、CD63、CD81、CD31、Rab5b膜表面標記分子表達，說明獲取的血清外泌體可用于蛋白檢測。見圖1。

2.2 2組病人一般臨床資料比較 2組病人在飲酒史、發熱、低鈣血癥、NIHSS評分、病灶累及皮質及eGFR、 IL-6、TGF-β1、TNF-α水平方面差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

注：A：透射電鏡下觀察外泌體顆粒形態和大小(×12000)； B：納米粒徑追蹤分析外泌體粒徑分布；C：流式細胞術檢測外泌體特征蛋白表達圖1 血清外泌體鑒定

表1 2組病人一般臨床資料比較(n，%)

2.3 2組病人血清外泌體蛋白TSP-1表達水平比較 PSE組血清外泌體蛋白TSP-1的表達水平經Western blot法及ELISA法檢測均顯著高于非PSE組病人，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 2組病人血清外泌體蛋白TSP-1表達水平比較

2.4 PSE的影響因素分析 多因素Logistic回歸分析顯示，發熱、低鈣血癥、NIHSS評分、血清外泌體蛋白TSP-1表達水平均是老年腦卒中病人發生PSE的獨立影響因子(P<0.05)。見表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析老年腦卒中病人發生PSE的影響因素

2.5 血清外泌體蛋白TSP-1預測PSE的價值 ROC曲線分析結果顯示，TSP-1對老年腦卒中病人發生PSE的預測效能AUC為0.886(95%CI：0.829～0.943)，閾值為146.565 pg/mL，在該閾值下，特異度和靈敏度分別為81.8%和87.0%，約登指數為0.688。見圖2。

圖2 血清外泌體蛋白TSP-1表達水平對老年腦卒中病人發生PSE預測價值的ROC曲線

2.6 PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達水平與炎癥因子和認知損害的相關性 Pearson相關性分析顯示，PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達與IL-6、TGF-β1、TNF-α均呈正相關(r=0.699，0.919，0.680，P<0.001)。Spearman相關性分析顯示，PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達與MMSE差值呈負相關(r=-0.768，P<0.001)。

3 討論

老年PSE的發病率差異很大，早期癲癇發病率更高[8]，其中出血轉化被認為是早期癲癇發作最重要的預測因素之一。TSP-1作為一種參與血管生成和炎癥反應重要的脫細胞蛋白，在其中的促進作用也不可忽視。本研究結果顯示， PSE組病人血清外泌體蛋白TSP-1表達顯著高于非PSE組病人，表明TSP-1可能參與了PSE的發病機制，此外血清外泌體蛋白TSP-1表達升高亦是老年腦卒中病人發生PSE的獨立預測因子。

本研究中，204例老年卒中病人發生PSE 23例(11.27%)。既往研究顯示，缺血性腦卒中發生PSE的原因是神經元的高代謝及高需氧量的特點，使其對缺氧高度敏感，在發生缺血性腦卒中急性期，中樞神經系統因缺血、缺氧釋放大量谷氨酸，引起神經細胞膜興奮、γ-氨基丁酸抑制性功能受損，進而降低了癲癇的閾值[9-11]。缺血、缺氧引起的腦組織損傷會導致葡萄糖代謝異常，同時因鈉、鉀泵功能受損，使細胞內鈉、鈣離子增加，電解質及酸堿平衡被破壞，導致細胞毒性水腫、急性代謝功能障礙，同樣影響神經元正常放電，引起癲癇發作。眾多研究表明，癲癇與炎癥反應息息相關，腦損傷可激活星形膠質細胞和小膠質細胞釋放促炎因子，誘導血腦屏障損傷引發癲癇，而在癲癇發作后，炎癥反應會加重，此時的神經組織微環境常伴隨著嚴重且持續的炎癥反應，形成癲癇發展的惡性循環[12]。本研究結果顯示，PSE組病人的IL-6、TGF-β1、TNF-α水平均顯著高于非PSE組。

TSP-1是一種黏附糖蛋白，最早發現于活化的血小板中，能介導細胞-細胞、細胞-基質的相互作用，在細胞表面表達并調節細胞生物學過程[13]。有研究基于蛋白質組學對輕度腦卒中和短暫性腦缺血發作的生物標志物進行分析，發現TSP-1是短暫性腦缺血發作狀態的潛在重要預測因素[14]。因此，本研究探究了血清外泌體蛋白TSP-1表達水平與老年腦卒中病人發生PSE的相關性，結果顯示TSP-1是老年腦卒中病人發生PSE的獨立影響因素，可預測老年腦卒中病人發生PSE。血漿中TSP-1水平在患有心血管疾病和炎癥性疾病以及通常伴有心血管并發癥的疾病病人中顯著升高，尤其是在缺血性血管疾病中更明顯，老年缺血性腦卒中病人的血漿TSP-1水平明顯高于正常對照組病人[15]，其重要的機制在于TSP-1通過激活TGF-β途徑，進而誘導炎癥因子表達；此外TSP-1可通過參與調節多種細胞表面受體及NF-κB的活性來影響炎癥反應，如TSP-1可通過對IL-1β通路發揮CD47依賴和不依賴的促炎和抗炎作用[16]，從而加重機體微炎癥狀態。在本研究中，PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達與IL-6、TGF-β1、TNF-α呈正相關。此外Cheng等[17]通過動物實驗發現，敲除TSP-1基因小鼠在顱腦外傷后血腦屏障損傷較野生型加重，且表現出運動、認知功能方面的嚴重神經功能缺損，Kim等[18]也證實人臍帶血間充質干細胞分泌的TSP-1可以恢復AD環境中的α2δ-1和Neuroligin-1受體的表達水平，減輕淀粉樣蛋白β肽誘導的突觸功能障礙，這與認知和記憶障礙密切相關，同時還與癲癇相關。因此我們進一步分析了血清外泌體蛋白TSP-1表達與PSE病人認知功能的關系，發現PSE病人血清外泌體蛋白TSP-1表達與MMSE差值呈負相關，PSE病人的血清外泌體蛋白TSP-1水平越高，越易出現認知損害。

綜上所述，對于老年缺血性腦卒中病人，血清外泌體蛋白TSP-1高表達者更易發生PSE，這可能與TSP-1激活TSP-1/TGF-β1途徑和誘導血清炎癥因子水平升高有關。此外，血清外泌體蛋白TSP-1高表達還可能加重PSE病人的認知損害。檢測血清外泌體蛋白TSP-1對預測老年腦卒中病人PSE發生風險有一定參考價值。而且血清外泌體蛋白TSP-1也有望成為預測老年腦卒中病人發生PSE的重要靶標。