痰液、肺泡灌洗液微生物輔助診斷老年肺結(jié)節(jié)良惡性的研究

朱穎 黃建峰 張勤 高敏 文昱婷 武良權(quán) 蔡偉 張允雷 張秀偉

現(xiàn)階段臨床上肺結(jié)節(jié)的良惡性辨別以及跟蹤監(jiān)測主要依賴于低劑量螺旋CT和穿刺活檢。但是在影像學(xué)上觀察到惡性肺結(jié)節(jié)時，少數(shù)肺癌的癌干細(xì)胞已經(jīng)成功侵入機(jī)體的其他器官，導(dǎo)致肺癌的發(fā)生[1]。大規(guī)模的臨床呼吸道樣本微生物16s測序結(jié)果表明，微生物的α多樣性和分布(均勻度) 在非惡性肺組織中明顯高于腫瘤肺組織[2]。然而，與健康人群相比，癌癥病例中的幾個微生物分類群已被證明是相當(dāng)豐富的。這些存在于肺癌組織中的定植菌，主要包括 流感嗜血桿菌、 腸桿菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌(G-)[3]。肺癌病人的顆粒桿菌、營養(yǎng)缺陷菌屬和鏈球菌屬的豐度明顯高于健康人群[4]。更重要的是，肺泡灌洗液中的巨球型菌屬、二氧化碳噬細(xì)胞菌屬、硬壁菌門和韋榮球菌屬細(xì)菌在預(yù)測肺鱗癌和肺腺癌方面已經(jīng)顯示出較高的AUC值，可以被用作肺癌的生物標(biāo)志物[5]。雖然這些研究結(jié)果具有明顯的地域性，不同國家和地區(qū)的研究結(jié)果差別較大。但是，上述研究充分說明痰液和肺泡灌洗液中的微生物中包含著肺癌的“蛛絲馬跡”。因此，本研究擬在痰液和肺泡灌洗液的一般細(xì)菌涂片檢查的結(jié)果中探究一種簡便快捷、適合老年病人的肺結(jié)節(jié)良惡性辨別方法。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2020年5月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院初次就診的94例老年肺癌病人和36例老年肺結(jié)節(jié)病人為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡>65歲；初次確診為肺癌或肺結(jié)節(jié)。排除標(biāo)準(zhǔn)：呼吸道感染和其他惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病病人等。將120例病人分為肺結(jié)節(jié)組(n=26)和肺癌組(n=94)，肺癌組又分為肺腺癌組(n=38)和肺鱗癌組(n=56)。肺結(jié)節(jié)組男19例，女17例，年齡65～76歲，平均(67.14 ± 7.81)歲，其中患有肺部基礎(chǔ)性疾病者共17例(主要包括慢性支氣管炎3例、COPD 4例、慢性支氣管炎合并COPD 5例、慢性支氣管炎合并肺氣腫3例和陳舊性肺結(jié)核2例)；肺腺癌組男23例，女15例，年齡66～79歲，平均(67.34 ± 9.59)歲，臨床分期(第八版臨床肺癌分期)為Ⅰ期的病人共12例，Ⅱ期及以上病人共26例，其中患有肺部慢性疾病的病人共7例(主要包括慢性支氣管炎1例、COPD 1例、肺氣腫2例、陳舊性肺結(jié)核1例、慢性支氣管炎合并肺氣腫1例和慢性支氣管炎合并COPD 1例)。肺鱗癌組男47例，女9例，年齡69 ～79歲，平均(68.63 ± 7.24)歲，臨床分期為Ⅰ期病人共13例，Ⅲ期病人共27例，Ⅳ期病人共16例，其中患有肺部慢性疾病的病人25例(主要包括慢性支氣管炎3例、COPD 6例、肺氣腫5例、陳舊性肺結(jié)核3例、慢性支氣管炎合并肺氣腫5例和慢性支氣管炎合并COPD 3例)。3組病人一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 歸類富集相關(guān)病例：按照上述研究對象的篩選標(biāo)準(zhǔn)，利用醫(yī)院醫(yī)療數(shù)據(jù)庫，通過相關(guān)代碼歸類富集相關(guān)病例，如肺結(jié)節(jié)(代碼：R91.X04)，肺腺癌(代碼：C34.908)，肺鱗癌(代碼：C34.907)，一般細(xì)菌涂片(編碼：250501001)和細(xì)菌真菌培養(yǎng)、鑒定(編碼：250501009-b)。其中，一般細(xì)菌涂片帶有白細(xì)胞和上皮細(xì)胞檢測的為痰液檢查，其他的為肺泡灌洗液檢查。

1.2.2 涂片檢查：痰液、肺泡灌洗液的一般涂片檢查：首先，取病人適量的肺泡灌洗液600～1000 r/min 離心10～20 min，取離心沉淀物進(jìn)行革蘭氏染色質(zhì)量評估，剩余肺泡灌洗液于1500～1800 r/min離心15～20 min，用接種環(huán)蘸取離心沉淀物，在玻片中央均勻地涂布成薄層。對于病人痰液，利用接種環(huán)直接蘸取后涂布于玻片中央。玻片自然干燥后，置于酒精燈火焰上方加熱固定，進(jìn)行常規(guī)革蘭氏染色和抗酸染色。

1.2.3 觀察指標(biāo)：記錄3組病人的痰液和肺泡灌洗液中一般細(xì)菌涂片的革蘭氏陽性菌(G+)、G-、抗酸桿菌和真菌的相對數(shù)量，同時記錄痰液中主要的微生物培養(yǎng)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)通過SPSS 22.0軟件處理，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)節(jié)和肺癌病人的痰液中主要病原菌菌群比較 肺結(jié)節(jié)病人在少量G-、少量G+和大量G+檢出率上與肺癌病人比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 肺結(jié)節(jié)和肺腺癌病人的痰液中主要病原菌菌群比較 肺結(jié)節(jié)病人中大量G+的檢出率更高(P<0.05)；肺腺癌病人中大量G-的檢出率更高(P<0.05)。見表1。

2.3 肺結(jié)節(jié)和肺鱗癌病人的痰液中主要病原菌菌群比較 肺結(jié)節(jié)病人痰液中少量G-、大量G+病原菌菌群檢出率顯著高于肺鱗癌病人(P<0.01)；肺鱗癌病人中少量G+病原菌菌群檢出率更高(P<0.05)。見表1。

表1 病人痰液中主要病原菌的診斷結(jié)果比較(n,%)

2.4 肺結(jié)節(jié)和肺癌病人的痰液中主要微生物培養(yǎng)結(jié)果比較 26例肺結(jié)節(jié)病人的痰液中，共有2例(7.69%)病人培養(yǎng)出白色假絲酵母菌；肺腺癌和肺鱗癌病人中分別有16例(42.11%)和8例(14.2%)培養(yǎng)出微生物。見表2。

表2 老年肺癌與肺結(jié)節(jié)病人痰液中主要微生物培養(yǎng)結(jié)果(n,%)

2.5 肺結(jié)節(jié)和肺癌病人的肺泡灌洗液細(xì)菌檢出率比較 肺泡灌洗液一般細(xì)菌涂片結(jié)果表明，病原菌在肺結(jié)節(jié)、肺腺癌、肺鱗癌和肺癌(包含肺腺癌和肺鱗癌)病人中的檢出率分別為11.54%、34.21%、33.90%和34.05%，肺癌病人的肺泡灌洗液一般細(xì)菌涂片的細(xì)菌檢出率顯著高于肺結(jié)節(jié)病人(P<0.05)。見圖1。

圖1 肺泡灌洗液一般細(xì)菌涂片檢測細(xì)菌檢出率

3 討論

肺癌的發(fā)生發(fā)展非常隱蔽，很多病人在早期并無不適癥狀[6]。肺癌的篩查主要借助于胸部低劑量螺旋CT，其特殊的肺部影像學(xué)特征可以快速判斷肺部腫瘤的良惡性[7]。但是，部分肺癌病人的CT影像學(xué)特征與肺結(jié)節(jié)相似，特別是早期肺癌病人有相當(dāng)一部分表現(xiàn)為肺結(jié)節(jié)，需要穿刺等有創(chuàng)診斷來協(xié)助確診[8-9]。有創(chuàng)活檢是肺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是針對老年病人身體健康狀況、活檢取材位置和檢測周期較長等影響，一般老年肺結(jié)節(jié)病人很難接受這種檢查。隨著低劑量螺旋CT檢查在常規(guī)體檢中的普及，肺結(jié)節(jié)病人快速增加，而肺結(jié)節(jié)病人中有30%～40%最終發(fā)展為惡性肺結(jié)節(jié)[10]。目前的研究表明，每年進(jìn)行1次低劑量螺旋 CT 不會對人體產(chǎn)生明顯的傷害。但是，低劑量螺旋 CT在肺癌篩查方面只有不到 30 年的歷史，且部分研究表明，低劑量螺旋CT會對血液細(xì)胞產(chǎn)生短暫的 DNA損傷[11]。更重要的是，盡管肺結(jié)節(jié)和肺癌的CT影像學(xué)特征顯著不同，但是部分病例仍無法通過影像學(xué)確診。因此，臨床上急需一種快捷無創(chuàng)的方法輔助辨別肺結(jié)節(jié)良惡性。新近研究表明，痰液和肺泡灌洗液中的微生物生態(tài)系統(tǒng)對肺癌的預(yù)測和診斷具有重要意義[1]。

本研究結(jié)果顯示，老年肺結(jié)節(jié)和肺癌病人在痰液和肺泡灌洗液的一般細(xì)菌涂片檢查結(jié)果上存在顯著性差異。在痰液的一般細(xì)菌涂片檢查中，肺結(jié)節(jié)病人在少量G-和大量G+檢出率顯著高于肺癌病人，而少量G+檢出率顯著低于肺癌病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明一般痰液涂片檢查具有辨別肺結(jié)節(jié)良惡性的潛力。當(dāng)肺結(jié)節(jié)病人與肺鱗癌病人進(jìn)一步比較時，其結(jié)果與肺癌病人一致。但是，肺腺癌病人與肺結(jié)節(jié)病人比較時，大量G-和大量G+檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而少量G-和少量G+檢出率沒有差異。進(jìn)一步的痰液細(xì)菌真菌培養(yǎng)結(jié)果表明，肺腺癌和肺鱗癌病人共培養(yǎng)出了7種不同的微生物，而肺結(jié)節(jié)病人僅培養(yǎng)出了白色假絲酵母菌。肺腺癌病人痰液中的微生物具有不同于一般肺癌病人的特征，事實上，痰液、肺泡灌洗液和胸腔積液涂片細(xì)胞學(xué)檢查和痰液細(xì)胞DNA倍體定量分析等技術(shù)已經(jīng)在肺癌診斷中被廣泛使用[12]。但是，這些檢測技術(shù)主要依賴于肺癌脫落的細(xì)胞，而中央型肺癌以及早期肺癌很難有脫落細(xì)胞被檢出。伴隨著人體微生物組學(xué)和測序技術(shù)的進(jìn)步，痰液及肺泡灌洗液的16s測序已經(jīng)在肺癌的早期診斷和良惡性辨別上顯示出重要的應(yīng)用價值[13-14]。但是，人體微生物組學(xué)的研究結(jié)果具有較強(qiáng)的地域性，很難被推廣應(yīng)用。更重要的是，這些研究結(jié)果只是證明了某些菌屬的種類或者豐度與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，并沒有形成具有臨床價值的檢測產(chǎn)品。同時，臨床上的16s測序更多地用于肺部病原菌的確定，成本較高，周期較長。本研究基于痰液和肺泡灌洗的微生物病原菌，通過一般細(xì)菌涂片探究肺結(jié)節(jié)和肺癌病人的差異，具有比細(xì)胞學(xué)檢測可靠，比16s測序更簡便快捷的特點。

綜上所述，本研究證明了痰液和肺泡灌洗液的一般細(xì)菌涂片檢查和細(xì)菌真菌培養(yǎng)具有辨別老年肺結(jié)節(jié)良惡性的作用，這種檢查方法具有簡便、快速和經(jīng)濟(jì)的特點，同時可以減少低劑量螺旋CT對老年病人的輻射傷害，具有重要的臨床應(yīng)用價值。