構建基于鐵死亡相關長鏈非編碼RNA的膽管癌預后模型

張 琳，石張鎮，白元松

(吉林大學中日聯誼醫院 血液腫瘤科，吉林 長春130033)

膽管癌(CCA)是一種侵襲性膽道上皮細胞惡性腫瘤，占原發肝癌的10%-15%[1]。目前，手術仍是首選治療CCA的方法[2]，然而由于缺乏典型的臨床癥狀，很難在早期診斷CCA，因此只有30%-40%的患者適合手術治療，且術后復發的概率較高[3]。鐵死亡是一種依賴鐵的調節性細胞死亡形式，由脂質過氧化過度引起，與多種腫瘤的發生和治療反應有關[4]。近年來，越來越多的證據表明鐵死亡具有抑制腫瘤的作用，可用于腫瘤的治療[5]。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是非蛋白質編碼的轉錄產物，參與多種復雜的生物過程[6]，lncRNAs在不同類型腫瘤的發生發展中發揮著重要作用[7]。本研究旨在利用公共數據庫中CCA的表達數據篩選出與鐵死亡基因相關的lncRNAs，然后基于這些lncRNAs構建CCA的預后生存模型。

1 材料與方法

1.1 獲取數據集

從TCGA 數據庫(https://gdc.nci.nih.gov/) 中下載 45 例膽管癌的基因表達數據和生存數據，基因表達數據與GENCODE數據庫資料(https://www.gencodegenes.org/hu-man/,gencode.v22)匹配添加注釋信息。從FerDb數據庫(http://www.zhounan.org/ferrdb/)中獲得259個鐵死亡相關基因[8]。

1.2 篩選鐵死亡相關的lncRNAs

用“limma”R包識別腫瘤組織與正常組織間差異表達的lncRNAs。通過Pearson 相關性分析計算識別出與鐵死亡基因表達量相關的差異 lncRNAs。

1.3 構建預后模型

1.4 基因功能富集分析

用“limma”R包獲得正常組織與腫瘤組織中差異表達基因，選擇與多因素COX分析篩選出的關鍵的影響預后的鐵死亡相關差異lncRNAs共表達的差異基因。用“clusterProfiler”R包對這些差異基因進行基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，研究這些基因所具有的生物學功能。

1.5 統計分析

所有的統計分析在R語言(4.0.4版本)中利用相關的R包進行，認為P<0.05 為有統計學差異。

2 結果

2.1 數據處理及預后模型的構建

經秩和檢驗及Pearson相關性分析獲得537個鐵死亡相關差異lncRNAs。通過單因素COX分析及多因素COX分析獲得3個用于構建預后模型的關鍵的鐵死亡相關差異lncRNAs，并得到風險評分公式：RS=3.93X LINC01714表達量+4.90X LINC02997表達量+-0.77X LINC01621表達量。用風險評分公式計算每個患者的得分，將高于中位得分的患者歸為高風險組，反之為低風險組。生存分析(K-M曲線)結果表明高風險組總存活率顯著低于低風險組(P=0.0012)(圖1)。ROC曲線得到1年，3年及5年的AUC分別為0.81、0.81及0.82，說明模型能夠較好的預測患者的預后(圖2)。

圖1 K-M曲線顯示高風險組和低風險組的患者預后

圖2 1年，3年和5年的ROC曲線

2.2 基因功能富集分析

在篩選出的312個與關鍵lncRNAs共表達的蛋白編碼差異基因中，功能富集分析顯示這些差異基因主要富集在酶抑制劑活性、脂質轉運體活性及鐵離子結合等。通路主要富集在膽汁分泌、化學致癌受體活化、PPAR信號通路及藥物代謝等。

3 討論

膽管癌具有很高的侵襲性，中位生存期小于24個月，是一種難治性預后差的惡性腫瘤。近年來，許多研究探索新的生物標志物和基因標記來預測膽管癌的預后[9-12]，也有部分研究通過鐵死亡相關lncRNAs構建模型來預測癌癥患者的預后[13-17]。提示鐵死亡相關的lncRNAs在調控腫瘤細胞中發揮關鍵作用。然而，在膽管癌中尚未發現用鐵死亡相關的lncRNAs評價預后的研究。本研究利用TCGA數據庫篩選了在腫瘤組織和正常組中差異表達的lncRNAs，用相關性分析獲得了鐵死亡相關的差異lncRNAs，經過單因素COX分析和多因素COX分析獲得了由“LINC01714”,“LINC02997”,“LINC01621”構建的預后模型，該模型可將CCA患者分為高風險組和低風險組，隨后用生存分析和ROC曲線證實了模型有良好的效能。在篩選的3個關鍵lncRNAs中，Li H等人通過體外和體內實驗證實LINC01714在CCA的發生發展中有重要意義[18]。研究表明，LINC01714與FOXO3蛋白相互作用，抑制其在CCA細胞中的磷酸化水平。這也為我們的研究結果提供了佐證，提示LINC01714可作為CCA患者治療的候選藥物。目前，尚沒有關于其余2個lncRNAs在腫瘤中的研究，對于本研究中新發現的這兩個預后lncRNAs標志物，尚需臨床和實驗的進一步研究探求其功能和機制。

本研究存在幾個局限性：首先，由于CCA的低發病率，從公共數據庫獲得的樣本較小。其次，研究結果沒有通過進一步的實驗驗證進一步闡明潛在的機制。盡管如此，本研究仍為膽管癌的個體化治療提供了有潛力的生物標志物，為膽管癌的預后和治療提供了新線索。