三子固本方多糖提取純化及其免疫活性初步研究*

歐立娟，黃愛華，于 洋，王 青

（廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

三子固本方（SZGB）由金櫻子、絞股藍、余甘子、五味子4味中藥組方，臨床用于治療糖尿病腎病（DN），在改善腎組織病變方面效果較好。三子固本方多糖（SRP）是SZGB經(jīng)水提醇沉制備而得，有研究顯示，SRP可減緩核因子（NF）-κB介導的模型小鼠DN的進展［1］。三子固本顆粒對DN模型大鼠具有抗氧化應激和抑制腎間質纖維化的作用［2］。DN模型大鼠機體除了存在不同程度的微炎癥、氧化應激、組織增生及纖維化等，還存在免疫功能低下狀況［3］，提示調節(jié)機體免疫功能可能有利于改善DN。現(xiàn)代藥理學研究表明，絞股藍、金櫻子、五味子及其多糖部位均有免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎、調血脂等作用，余甘子具有增強免疫、抗氧化、調節(jié)糖代謝及脂代謝等作用［4-8］，提示SZGB可能具有免疫調節(jié)作用，多糖可能是其主要的物質基礎。鑒于此，本研究中優(yōu)化了SRP的提取工藝，對SRP進行初步分離純化，同時觀察了SRP對DN模型小鼠免疫功能的影響，旨在為闡明SRP治療DN的作用機制提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料

儀器：DKN612C型鼓風干燥箱、CF311C型旋轉蒸發(fā)儀（日本Yamato公司）；722s型紫外-可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；Milli-Q型蒸餾水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；TG16-WS型高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；CBS-B型程控多功能全自動部分收集器、DHL-N型電腦數(shù)顯定時恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；MCO175型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；CX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；M200型多功能酶標儀（瑞典Tecan公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

試藥：葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110833-201707，含量99.90%）；注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為18091821）；中綿羊紅細胞（SRBC，新鮮綿羊全血購自廣州石馬實驗場）；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號為31800-014）；胎牛血清（美國HyClone公司，批號為NSK0069）；羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液（CAS No.7365-45-9）、刀豆凝集素A（ConA，CAS No.11028-71-0），均購自美國Sigma公司；細胞增殖檢測試劑（CCK-8）盒（日本Dojindo公司，批號為WF856）；DEAE-52纖維素柱（批號為HA-0820）、Sephadex G-100凝膠柱（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司，批號為HA-0260）；中華墨汁（北京一得閣工貿(mào)集團）；水為蒸餾水。金櫻子（批號為20190303）、絞股藍（批號為20190404）、五味子（批號為20190312）、余甘子（批號為20190310）藥材飲片，均購自廣州市藥材公司中藥飲片廠。

動物：SPF級NIH系小鼠200只，體質量18～22 g，雌雄各半，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2019-0047。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃，相對濕度60%。實驗符合中國動物福利法，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學動物實驗管理和使用委員會批準。

細胞：YAC-1細胞，購自中山大學細胞中心。

2 方法與結果

2.1 SRP提取工藝優(yōu)化

2.1.1 總多糖含量測定

顯色條件：取葡萄糖對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶，以水溶解，依次加入1.2 mL 5%苯酚溶液、6 mL濃硫酸，定容，30℃恒溫水浴30 min，取出，冷卻至室溫［9］。

溶液制備：稱取葡萄糖對照品51.60 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水定容，即得質量濃度為1.032 mg/mL的對照品溶液。將SZGB中4味藥材飲片分別打粉過篩，按復方比例混勻，加入一定體積的水，煎煮浸提，濾過，即得供試品溶液。

方法學考察：1）線性關系考察，精密量取“溶液制備”項下對照品溶液0，1，2，2.5，4，5 mL，分別置10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，制成系列對照品溶液。按“顯色條件”項下方法制成質量濃度為0，10.32，20.64，25.80，41.28，51.60μg/mL的系列待測溶液，于490 nm波長處測定吸光度（O D）［9］。以葡萄糖質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.245X-0.023 8（R2=0.997）。結果表明，葡萄糖質量濃度在0～51.60μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。2）按2020年版《中國藥典（一部）》相關標準進行精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收試驗，結果葡萄糖吸光度的R SD分別為0.26%（n=6）、1.19%（n=6）、1.98%（n=6），表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置5 h內基本穩(wěn)定，方法重復性良好，平均加樣回收率為99.10%，RSD為2.46%（n=6）。

2.1.2 正交試驗

以提取時間（因素A）、提取次數(shù)（因素B）、料液比（因素C）為考察因素，以總多糖含量為評價指標，采用L9（34）正交試驗法優(yōu)選SRP的最佳提取工藝［10］。因素水平見表1，正交試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。由表2及表3可知，各因素作用強弱依次為B＞A＞C。根據(jù)實際情況綜合考慮，確定SRP最佳提取工藝是A3B2C3，即提取2次、料液比1∶20、每次提取2.5 h。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

表2 L9（34）正交試驗設計及結果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結果Tab.3 Results of ANOVA

2.1.3 驗證試驗

按處方比例稱量復方藥材3份，采用優(yōu)化提取條件進行工藝驗證試驗，測得總多糖平均含量為105.32 mg/g（得率0.98%），RS D為3.07%（n=3）。總多糖含量接近正交試驗表中的最高值，且重復性好，工藝穩(wěn)定合理。

2.2 SRP制備

取4種藥材飲片粉末（過50目篩），混合均勻，石油醚浸泡24 h，脫脂后干燥。按最佳工藝煎煮，合并續(xù)濾液，80℃及60 r/min條件下濃縮至原有體積的1/4，與95%乙醇（1∶4，m/V）混勻，4℃放置24 h，常規(guī)離心，去除上清液，得褐色沉淀物，60℃干燥，即得SRP［11］。

2.3 SRP分離純化［12］

DEAE-52纖維素柱：采用Sevage法除蛋白后，取適量的SRP，加水，充分溶解制成1.0 mg/mL的SRP溶液，緩慢加到已平衡好的DEAE-52纖維素柱中，依次用蒸餾水及0.1，0.3，0.5 mol/mL的NaCl溶液洗脫，每梯度20管，每管10 min，流速為1.0 mL/min。全自動部分收集器收集洗脫液，以苯酚-硫酸法在490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標、收集管數(shù)為橫坐標繪制洗脫曲線。結果DEAE-52纖維素柱對SRP具有明顯的分離效果，分別在水及0.1，0.3 mol/mL NaCl溶液處分離出多糖成分，收集各洗脫峰部分命名為A，B，C，60℃下旋轉蒸發(fā)濃縮。洗脫曲線見圖2。

Sephadex G-100凝膠柱：取上述A，B，C收集液5 mL，分別加到已平衡好的Sephadex G-100凝膠柱中，以流速為0.1 mL/min的水洗脫，每管10 min，收集各洗脫液，以苯酚-硫酸法在490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標、收集管數(shù)為橫坐標繪制洗脫曲線。結果成分A無法分離，洗脫條件有待進一步優(yōu)化；成分B為單一峰，且峰形相對對稱，表明B為單一成分，有待確定其結構；成分C有2個分子量較集中的組分構成，有待進一步分離。洗脫曲線見圖3。

2.4 小鼠免疫功能影響實驗

2.4.1 小鼠溶血素生成實驗及臟器指數(shù)測定

將50只NIH小鼠分為正常對照組（等體積水）、模型組（等體積水）、三子固本方原液（SZGB）組（4 700 mg/kg）及SRP低、高劑量組（SZGB組，1 010，2 020 mg/kg），各10只。灌胃給藥或水，每日1次，連續(xù)15 d。給藥第12天時，腹腔注射環(huán)磷酰胺（120 mg/kg）以復制免疫功能低下小鼠模型，同時腹腔注射5%SRBC致敏。末次給藥后第1天，取全血上清液，加入有2.5%SRBC、1∶10豚鼠補體的試管中，混勻，為待測樣品；以生理鹽水為空白樣品。各樣品37℃水浴40 min，后置冰水中10 min終止反應。2 000 r/min離心10 min，取上清液200μL，以空白樣品調零，以酶標儀在540 nm波長處測定待測樣品吸光度［13］，以該值表示溶血素生成量。同時取小鼠胸腺、脾臟稱定濕質量（mg），除以對應小鼠的體質量再乘以10，即得脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。與正常對照組比較，模型組溶血素生成量、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，SZGB組及SRP低、高劑量組溶血素生成量顯著增加（P＜0.05）。詳見表4。

表4 各組溶血素生成量及胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of hemolysin production，thymus index and spleen index in each group（±s，n=10）

表4 各組溶血素生成量及胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of hemolysin production，thymus index and spleen index in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。表5同。Note：Compared with those in the normal control group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with those in the model group，*P＜0.05，**P＜0.01（for Tab.4-5）.

組別正常對照組模型組SZGB組SRP低劑量組SRP高劑量組吸光度1.599 9±0.257 8 0.096 0±0.011 4##0.107 0±0.004 5*0.107 5±0.005 0**0.108 6±0.006 2**胸腺指數(shù)17.99±5.35 12.03±3.58##10.88±3.62 10.84±3.31 10.68±3.14脾臟指數(shù)55.72±9.93 29.16±5.80##28.80±6.90 26.47±3.57 29.46±8.47

2.4.2 小鼠碳廓清實驗

同2.4.1項下方法分組及給藥。末次給藥后第1天，尾靜脈注射稀釋墨汁，分別于注射后2，20 min眼眶后靜脈叢取血20μL，脫頸椎處死小鼠，取其肝臟和脾臟立即稱質量（濕質量）。以酶標儀在570 nm波長處測定其吸光度，按下式計算廓清指數(shù)（K）和校正廓清指數(shù)（α），以α表示碳廓清能力。與正常對照組比較，模型組α顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SZGB組及SRP低、高劑量組α顯著升高（P＜0.05）。詳見表5。

表5 各組α、NK細胞殺傷活性、SI比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of ofα，killing activity of NK cells and SI in each group（±s，n=10）

表5 各組α、NK細胞殺傷活性、SI比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of ofα，killing activity of NK cells and SI in each group（±s，n=10）

組別正常對照組模型組SZGB組SRP低劑量組SRP高劑量組α 3.53±0.37 3.11±0.46#3.43±0.15*3.70±0.27*3.72±0.40*NK細胞殺傷活性（%）20.10±2.59 15.47±1.38#17.17±0.96*18.95±2.71*19.05±2.42**SI 2.02±0.85 1.04±0.28#1.37±0.30 1.63±0.73 1.81±0.74*

O D1為t1（2 min）血樣本的O D值，OD2為t2（20 min）血樣本的O D值。

2.4.3 小鼠NK細胞活性實驗

取傳代1 d生長的YAC-1細胞，以磷酸鹽緩沖液（PBS）調細胞密度至2×106mL-1，加入終濃度為1μmol/L的熒光染料CFSE，混勻后染色10 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調細胞密度至1×105mL-1。實驗分為正常對照組、模型組、SZGB組及SRP低、高劑量組。取效應細胞（小鼠脾細胞）及靶細胞（YAC-1細胞）各100μL，加入96孔U底板內（效靶比例為50∶1）。37℃下孵育約4 h，收集細胞置5 mL離心管中，加1 mL PBS，1 200 r/min離心10 min。棄上清液，用400μL PBS重懸細胞，加20μL PI溶液，染色5 min，以流式細胞儀分析細胞凋亡情況。以CFSE和PI雙陽性細胞為死亡靶細胞，按公式［NK殺傷活性（%）=（實驗組死亡率-正常對照組死亡率）/（100%-正常對照組死亡率）×100%］計算NK細胞殺傷活性（正常對照組死亡率是指未加入效應細胞時，YAC-1細胞自發(fā)死亡率）。與正常對照組比較，模型組NK細胞殺傷活性顯著減弱（P＜0.05）；與模型組比較，SZGB組及SRP低、高劑量組NK細胞殺傷活性顯著增強（P＜0.05）。詳見表5。

2.4.4 小鼠脾淋巴細胞增殖實驗［14-15］

同2.4.1項下方法分組及給藥。末次給藥后第1天，頸椎脫臼處死小鼠，無菌取其脾臟，常規(guī)制備脾細胞懸液，1 200 r/min離心10 min，收集細胞，用消毒超純水溶解紅細胞，以等量1.8%高滲氯化鈉溶液恢復其等滲狀態(tài)。裂解紅細胞后，洗滌淋巴細胞2次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調細胞數(shù)至2×106mL-1，細胞培養(yǎng)板每孔加入0.2 mL細胞懸液及0.01 mL ConA，以未加ConA的孔作對照，以RPMI 1640培養(yǎng)液作空白對照，各組均采用3個復孔。5%CO2、37℃、飽和濕度下培養(yǎng)72 h，于培養(yǎng)結束前1 h，每孔小心吸棄100μL培養(yǎng)液上清液，加入CCK-8，每孔0.01 mL。以酶標儀在450 nm波長處測定吸光度，刺激指數(shù)（SI）=（ConA孔吸光度-空白對照組吸光度）/（對照孔吸光度-空白對照組吸光度）。與正常對照組比較，模型組SI顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SRP高劑量組SI顯著升高（P＜0.05）。詳見表5。

3 討論

本研究中將SZGB中的多糖提取出來單獨用藥具有如下優(yōu)點：1）可解決患者服藥量大的問題，避免煎煮中藥的不便；2）SRP制備后，可在一定程度上增強藥效；3）SRP制備過程及質量控制的建立，可一定程度解決中藥復方質量難把控的難題。SRP是由SZGB經(jīng)熱水浸提制備得到。在制備過程中，參考了文獻報道的水提醇沉法，發(fā)現(xiàn)多糖經(jīng)過凍干機冷凍干燥后得到的成品比60℃干燥后得到的多糖成品具有更強的吸濕性，故本研究中SRP未作凍干處理，均采用60℃干燥法。

本研究中SRP采用Sevage法除蛋白，同時比較了多糖損失和蛋白清除率的變化。結果除蛋白后SRP純度較高，但損失率超過34.1%，總量較少，這是制約純化多糖應用于動物實驗的主要因素。因此，本研究中采用未除蛋白的SRP用于小鼠免疫功能方面的研究。

機體的免疫功能包括體液免疫、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性和細胞免疫4個方面［16-17］。本研究中分別通過溶血素生成（體液免疫）、小鼠碳廓清能力（單核-巨噬細胞功能）、NK細胞殺傷活性和脾淋巴細胞增殖實驗（T細胞免疫功能），探討SRP對免疫功能低下模型小鼠的影響。結果顯示，SZGB和SRP均能不同程度提升模型小鼠的免疫功能。在體液免疫方面效果尤其顯著，提示在各給藥組的溶血素水平均顯著升高，表明提高B細胞免疫功能可能是其增強機體免疫力的主要途徑之一；但ConA刺激的小鼠脾淋巴細胞增殖實驗中僅有SRP高劑量組的變化具有統(tǒng)計學意義，提示在細胞免疫方面作用可能較弱；單核-巨噬細胞功能和NK細胞活性方面均有較好的改善效果；SRP比SZGB對小鼠免疫功能具有更好的改善作用。

綜上所述，提取工藝的優(yōu)化在一定程度上提高了SRP的提取率，分離純化為SRP進一步的質量標準研究奠定了基礎。本研究中雖證實了SRP具有增強模型小鼠免疫功能的作用，但在免疫機制方面的研究較淺，如通過何種有效成分來調節(jié)，以及調節(jié)免疫活性的途徑等尚未清晰，仍需進一步研究。