薏苡仁破壁飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

張 寧，徐 劍，2，3△，繆艷燕，2，3，劉 耀，2，3，田洪星，張永萍，2，3

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽550025；3.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025）

薏苡仁首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名薏仁米、薏仁、薏米，為禾本科植物薏苡Coivlamcryma-jobi L.var.ma yuen（Roman）Stapf的成熟種仁［1］，產(chǎn)于福建、河北、遼寧等地。薏苡仁作為一種藥食同源的中藥，迄今已有兩千多年的食用歷史［2］。研究表明，薏苡仁有提高免疫力、減肥、抗疲勞、增加骨密度、抗氧化、美白、減輕輻射危害等作用，具有廣闊的研發(fā)前景［3］。中藥破壁飲片是經(jīng)超微粉碎［4］后粒徑D90＜45μm（300目以上）的一種微米級新型中藥飲片，可直接口服。與傳統(tǒng)飲片相比，破壁飲片具有諸多優(yōu)點(diǎn)［5］，如改良了傳統(tǒng)飲片的不均一性，提高了藥效，提升了飲片的利用率、穩(wěn)定性、質(zhì)量可控性及便攜性。本研究中從性狀、顯微特征、水分、總灰分、浸出物、薄層色譜（TLC）鑒別、粒徑分布、指紋圖譜及含量測定等方面建立薏苡仁破壁飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2308型激光粒度分析儀（濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司）；Model-200S-ELSD蒸發(fā)光散射檢測器（美國Softa公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ATY224型電子分析天平（萬分之一，瑞士Mettler Toledo公司）；AUW120D型電子分析天平（十萬分之一，日本Shimadzu公司）；HBM-109型超微粉碎機(jī)（瑞安市瀚博機(jī)電有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；L1100型光學(xué)生物顯微鏡（南京山特儀器有限公司）；GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；XTA400型多功能粉碎機(jī)（永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；HWHS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（金壇市瑞華儀器有限公司）。

1.2 試藥

甘油三油酸酯對照品（批號為110737-201516，含量≥98%）；薏苡仁油對照提取物（批號為111750-201503，含量≥98%），均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；其余試劑均為分析純。薏苡仁藥材（來源見表1）均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為正品。

表1 薏苡仁藥材來源信息Tab.1 Source information of Coicis Semen

2 方法與結(jié)果

2.1 薏苡仁破壁飲片制備

取薏苡仁藥材適量，粉碎，過六號篩，將細(xì)粉進(jìn)行超微粉碎，得破壁粉，混勻，加29.5%乙醇（0.44∶1，m/V），制粒，過35目篩，采用電熱鼓風(fēng)干燥，干燥溫度為60℃，干燥時間為70 min，過35目篩，整粒，即得樣品（編號為S1-S12）［6］。

2.2 性狀鑒別

破壁粉呈淡類白色，氣微，味微甜。

2.3 顯微鑒別

取破壁粉適量，用水合氯醛加熱透化，稀甘油固定后置顯微鏡下觀察，可見細(xì)小或不成型淀粉粒。

2.4 水分測定

按2020年版《中國藥典（四部）》通則0832第二法項下條件測定。結(jié)果12批樣品含水量為4.58%～4.82%。詳見表1。

2.5 總灰分測定

按2020年版《中國藥典（四部）》通則2302總灰分測定法項下條件測定。結(jié)果12批樣品總灰分為1.18%～1.56%。詳見表1。

2.6 浸出物測定

按2020年版《中國藥典（四部）》通則2201醇溶性浸出物測定法項下條件測定，以無水乙醇作溶劑。結(jié)果12批樣品浸出物含量為7.01%～8.78%。詳見表2。

表2 樣品水分、總灰分、浸出物含量測定結(jié)果（%）Tab.2 Results of content determination moisture，total ash and extract of wall-broken decoction pieces of Coicis Semen（%）

2.7 TLC鑒別

取樣品粉末1 g，加石油醚30 mL，超聲（功率300 W，頻率50 kHz，下同）處理30 min，濾過，取濾液，即得供試品溶液。取薏苡仁油對照提取物，加石油醚（60～90℃）制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的薏苡仁油對照提取物溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（8.5∶0.8∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，碘蒸氣熏蒸至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果5批樣品在與薏苡仁油對照提取物溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。詳見圖2。

2.8 樣品粒徑測定

取薏苡仁破壁粉，采用激光粒度儀、干法檢測儀測定［7-8］粒徑分布D90。測定時間：10 s；背景掃描時間：10 s；循環(huán)次數(shù)：1次；密度：1.06 g/cm3；最低限度：0.1%；最高限度：15%；空氣壓力：3 bar；進(jìn)樣速度：50%；測定模式：普通模式。粒徑測定結(jié)果見表3，粒徑分布見圖3。

表3 樣品粒徑測定結(jié)果（μm，n=12）Tab.3 Determination results of the particle size of samples（μm，n=12）

2.9 樣品細(xì)胞破壁率計算

采用細(xì)胞破壁率公式［9］計算，η=1-（1-1/n）3，η為破壁率，n為粉末粒徑與細(xì)胞尺寸的比值。當(dāng)n≤1時，η=100%；n＞1時，視n值大小決定；細(xì)胞最小尺寸可按10μm確定。結(jié)果樣品細(xì)胞破壁率為80.22%～82.81%。

2.10 高效液相色譜指紋圖譜鑒別

2.10.1 色譜條件

色譜柱：Odyssil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-二氯甲烷（60∶40，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL；ELSD參數(shù)：漂移管溫度80℃，空氣體積流量為2.0 L/min。

2.10.2 供試品溶液制備

取樣品0.6 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加乙腈-二氯甲烷（60∶40，V/V）50 mL，稱定質(zhì)量，浸泡2 h，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用流動相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.10.3 方法學(xué)考察

精密度試驗：取藥材樣品適量，按2.10.2項下方法制備供試品溶液，按2.10.1項下色譜條件進(jìn)樣測定6次，以甘油三油酸酯峰（6號峰）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果的R S D均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.10.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.10.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以甘油三油酸酯峰（6號峰）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密稱取樣品適量，各6份，按2.10.2項下方法制備供試品溶液，再按2.10.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以甘油三油酸酯峰（6號峰）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果的R SD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.10.4 指紋圖譜建立

取樣品12批，按2.10.2項下方法制備供試品溶液，按2.10.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，12批樣品指紋圖譜見圖4。將所得圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版），以中位數(shù)法分析，自動生成各批次樣品指紋圖譜的共有模式，見圖5。共標(biāo)定7個特征峰，其中1號峰為三亞油酸甘油酯，2號峰為1，2-亞油酸-3-油酸甘油酯，3號峰為3-棕櫚酸二亞油酸，4號峰為1，2-油酸-3-亞油酸甘油酯，5號峰為棕櫚酸亞油酸甘油酯，6號峰為甘油三油酸酯（參照峰），7號峰為棕櫚酸二油酸甘油酯。以共有模式為R對照圖譜，測得各批次與對照指紋圖譜之間的相似度，結(jié)果表明，12批樣品相似度為0.979～1，故各批次薏苡仁破壁飲片質(zhì)量均較穩(wěn)定。

2.11 甘油三油酸酯含量測定

2.11.1 溶液制備

取甘油三油酸酯對照品適量，精密稱定，加流動相制成質(zhì)量濃度為0.14 mg/mL的甘油三油酸酯對照品溶液。以流動相作空白對照溶液。

2.11.2 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.11.1項下對照品溶液、2.10.2項下供試品溶液、2.7項下薏苡仁油對照提取物溶液各適量，按2.10.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。詳見圖6。結(jié)果理論板數(shù)按甘油三油酸酯峰計應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

線性關(guān)系考察：取甘油三油酸酯對照品適量，精密稱定，加流動相，制得質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL的對照品貯備液，加流動相定容，制成系列對照品溶液。按2.10.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以甘油三油酸酯質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=14 250X-1 154.6（R2=0.999 3）。結(jié)果表明，甘油三油酸酯質(zhì)量濃度在0.10～0.35 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗：按相關(guān)要求進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗。結(jié)果甘油三油酸酯峰面積的R S D均小于3.0%（n=6），表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。平均回樣回收率為100.49%，RSD為2.15%（n=9）。

2.11.3 含量測定

取12批樣品各適量，分別按2.10.2項下方法制備供試品溶液，再按2.10.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果見表4。

表4 12批樣品含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.4 Content determination of glycerol trioleate in 12 batches of samples（%，n=3）

3 討論

本研究中參考2020年版《中國藥典（四部）》薏苡仁中控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的項目［10-14］。12批薏苡仁破壁飲片的水分平均值為4.71%，總灰分含量平均值為1.41%，浸出物含量平均值為7.74%，粒徑平均值為23.28μm，按不高于平均值的20%［5］制訂標(biāo)準(zhǔn)；細(xì)胞破壁率平均值為81.45%，12批薏苡仁破壁飲片指紋圖譜的相似度平均值為0.998，甘油三油酸酯含量平均值為0.52%，按下調(diào)20%為含量的最低限度。通過試驗數(shù)據(jù)和參考《中國藥典》中的檢查項目，制訂薏苡仁破壁飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：水分不得高于5.65%，總灰分含量不得高于1.69%，粒徑不得大于27.93μm，細(xì)胞破壁率不得低于65.16%，指紋圖譜鑒別樣品和對照藥材相似度不得低于0.798，甘油三油酸酯含量不得低于0.42%。

本研究中對薏苡仁破壁飲片制備方法進(jìn)行考察，比較了遠(yuǎn)紅外干燥箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱、真空干燥箱，并對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、干燥時間、干燥溫度、制粒篩網(wǎng)進(jìn)行考察。最終確定干燥方法為電熱鼓風(fēng)干燥，干燥溫度為60℃，干燥時間為70 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為27%，料液比為0.40∶1。

預(yù)試驗中考察了霧化溫度（50，70，80，100℃），結(jié)果表明80℃時效果最佳。當(dāng)溫度高于100℃時，破壁飲片成分已被揮發(fā)。考察了流速分別為0.8，1，1.2 mL/min時對色譜分離效果的影響，結(jié)果表明，流量過小，分離效果較差，過大也易造成拖尾。因此當(dāng)流速為1 mL/min時，峰形較佳。對Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）和Odyssil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）進(jìn)行了考察，結(jié)果均能很好地分離，其中Odyssil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）的分離效果最好。參考文獻(xiàn)［15］及2020年版《中國藥典》考察比較了乙腈-二氯甲烷（60∶40，V/V）、乙腈-環(huán)己烷（60∶40，V/V）、乙腈-異丙醇（60∶40，V/V）3種流動相，結(jié)果表明，流動相為乙腈-二氯甲烷（60∶40，V/V）時的色譜峰峰形及分離度最好。在以上條件的基礎(chǔ)上選擇柱溫20℃、25℃、30℃和35℃進(jìn)行考察，結(jié)果表明，柱溫為25℃時，洗脫效果較好，且各色譜峰間分離度和峰形均較好。考察了5μL、10μL和15μL的進(jìn)樣量，結(jié)果表明，進(jìn)樣量為20μL時，各色譜峰的響應(yīng)值較高，各峰之間分離度較好。

中藥破壁飲片具有成分利用率高、服用方便、配伍靈活等優(yōu)點(diǎn)［16］，應(yīng)用劑量比其傳統(tǒng)飲片量小，且與同等劑量的傳統(tǒng)飲片相比，藥效可增加3～5倍［17］。本研究可為企業(yè)生產(chǎn)薏苡仁破壁飲片的質(zhì)量控制提供一定的借鑒，為制訂薏苡仁破壁飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。