檳榔間作香露兜對土壤細菌群落結構和多樣性的影響

鐘壹鳴，張 昂，王志勇，秦曉威，廖 麗，吉訓志，魚 歡

(1.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所/海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室/農業農村部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室，海南 萬寧 571533；2.熱帶特色林木花卉遺傳與種質創新教育部重點實驗室/海南大學林學院，海口 570228)

【研究意義】檳榔(ArecacatechuL.)廣泛分布于包括我國在內的東南亞和南亞地區[1]，其中海南是我國最主要的檳榔產地[2]。檳榔種植株行距一般在2.5 m左右，適宜在檳榔林下間作可可、香草蘭、咖啡、胡椒和香露兜等作物[3]。香露兜(PandanusamaryllifoliusRoxb.)又稱斑蘭葉、香蘭葉，是一種喜濕耐蔭蔽的多年生草本香料植物[4]，在食品、化妝品等行業均有廣泛應用[5]，適宜發展成為檳榔林下間作的高價值經濟作物。土壤微生物在維持土壤健康和服務農業生態方面具有重要意義[6]，土壤微生物群落結構和多樣性的變化是表征土壤健康程度的理想生物學指標，通過觀察土壤微生物短時間內的變化能夠反映土壤健康狀況[7]。探究土壤微生物多樣性和群落變化與種植模式間的關系可深入了解土壤的健康程度，為土壤改良及作物綠色生態種植提供科學依據和理論指導[8]。因此，研究檳榔間作香露兜模式下土壤微生物的變化特征對該模式的推廣應用具有重要意義。【前人研究進展】間作模式下植株可充分利用光溫水肥等環境資源并促進植物生長發育、提高作物產量并增加單位面積產值[9]。然而目前國內外對檳榔間作香露兜體系的研究尚處于起步階段，前期研究表明，檳榔間作香露兜后土壤中速效磷含量增加，間作模式促進作物對養分的吸收，養分吸收效率和根系形態呈顯著正相關[10]。檳榔間作香露兜可促進檳榔干物質積累并增加檳榔葉片SPAD值，間作后檳榔的根系指標顯著增加，土壤酶活顯著提高[11]。類似研究也表明，檳榔間作平托花生模式下的酸性速效磷、全磷、全鉀、速效鉀含量及pH顯著提高[12],土壤細菌的物種豐富度和群落多樣性均有所提高。王華等[13]研究發現，檳榔間作香草蘭后土壤pH、有機質、微量元素、速效及全量養分含量均顯著提高，并有效改良土壤微生物群落比例。吳紅英等[14]研究表明，梨園間作芳香植物能顯著提高各發育時期和不同深度土層中土壤微生物數量，調節真細菌及放線菌比例。同時，土壤中不同種類的微生物與土壤養分及理化性質等諸多因子間也存在顯著相關。甕巧云等[15]研究發現玉米/大豆間作后能夠明顯改善土壤養分含量及微生物群落結構。李艷春等[16]研究發現，間作靈芝后，茶園土壤變形菌門豐度顯著提高，酸桿菌門和芽孢菌門豐度顯著降低，土壤有益微生物菌群伯克氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和戴氏菌屬均顯著提高。趙雅姣等[17]研究發現，紫花苜蓿—小黑麥間作后，根際土壤放線菌門相對豐度顯著降低，酸桿菌門、擬桿菌門和疣微菌門相對豐度顯著增加。【本研究切入點】檳榔間作香露兜后土壤細菌群落結構變化尚未可知，該間作模式下土壤細菌群落關鍵調控因子也有待進一步探究。【擬解決的關鍵問題】通過探究土壤細菌群落結構在不同種植模式下豐度和多樣性變化及其與土壤理化性質指標間的互作關系，明確檳榔間作香露兜模式影響土壤細菌群落的關鍵調控因子，為優化檳榔間作香露兜模式及熱帶農田經濟的發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗采樣地位于海南省萬寧市興隆熱帶植物園內(109°56′E，18°31′N，海拔36 m)，海南省地處熱帶北緣，屬熱帶季風氣候，陽光充足，雨量豐富，年平均氣溫23 ℃，年均降水量在2100 mm左右，年光照為1750～2650 h，光照率為50%～60%，年無霜期大于350 d。采樣地土壤理化性質：土壤pH 6.15，有機質含量22.06 g/kg，全氮1.49 g/kg，全磷1.28 g/kg，全鉀6.29 g/kg，堿解氮93.80 mg/kg，速效磷8.86 mg/kg，速效鉀39.25 mg/kg。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設計 采用大田試驗的方法，設檳榔單作、香露兜單作和檳榔間作香露兜3種種植模式，各種植模式下均設3塊20 m×20 m的樣方。樣方內檳榔與香露兜種植株行距分別為2.5和0.5 m。于2019年布置試驗，試驗期間各樣地水肥管理、病蟲害防治等田間管理均保持一致。

1.2.2 土壤理化性質測定 于2020年6月對土樣進行收集，以環刀法采集距離植株20～30 cm處的耕層土壤，用于土壤含水量(Soil moisture content，SM)、電導率(Electrical conductivity，EC)和容重(Bulk density，BD)測定；稱量鮮重后，將土壤樣品烘干后再次稱重，得到土壤干重并計算質量差值，與鮮重比值即為土壤含水量，土壤容重=土壤干重/土壤體積。通過五點法進行采樣，將同一樣點所取土樣混勻并自然風干，過篩(80目，約0.18 mm)后用于土壤養分測定；pH使用FE28型pH計測定、電導率使用DDS-307A型電導率儀測定、有機質(Soil organic matter，SOM)采用總有機碳分析儀(Multi N/C 3100)測定、全氮(Total nitrogen，TN)采用半微量凱氏法測定、全磷(Total phosphorus，TP)采用Na2CO3熔融法測定、全鉀(Total potassium，TK)采用NaOH水解法進行測定[18]。

1.2.3 土壤微生物測定 于每塊樣地的3個處理內分別隨機選取9個樣點采集表層土(0～10 cm)，將每個樣點采集的少量土樣混勻后置于超低溫冰箱，用于土壤細菌豐度和多樣性測定。土壤總DNA采用DNA提取試劑盒提取和純化：利用標記有barcode的引物序列(967F/1046R)擴增土壤細菌16S rRNA序列V3～V4區片段，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物片段長度，根據定量檢測結果，將擴增產物混合為一個樣本，構建克隆文庫；利用Illumina MiSeq高通量平臺測序，數據經Flash軟件雙端序列拼接、質控、去接頭(https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml)之后獲得優化序列，基于優化序列進行OTU聚類(http://www.drive5.com/uparse/)，獲得OTU豐度表，用于后續細菌多樣性指數及細菌群落構成分析。

1.3 統計分析

使用SPSS 24.0進行單因素方差分析，比較不同種植模式間環境因子間差異。采用Canoco 4.5進行冗余分析(RDA)，在RDA中選擇Manual forward selection程序以具有499個排列的蒙特卡羅測試確定環境變量參數的顯著性，用于判斷環境因子對細菌群落的影響程度。使用R 4.0.3進行相關分析，探索不同土壤指標與土壤細菌優勢菌門間的相關性，并以Origin 2021進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同種植模式對土壤理化性狀指標的影響

單因素方差分析結果(表1)表明，檳榔間作香露兜后，其土壤pH平均值為5.53，而檳榔單作和香露兜單作分別為6.15和5.49。相對于檳榔單作，間作香露后土壤pH降低0.62，存在顯著差異(P<0.05，下同)，與香露兜單作不存在顯著差異(P>0.05，下同)；檳榔間作香露兜后土壤電導率增加至123.27 S/m，分別較檳榔單作(76.13 S/m)和香露兜單作(94.37 S/m)顯著提高61.92%和30.61%；檳榔間作香露兜后土壤容重相較檳榔單作和香露兜單作分別提高24.00%和29.17%；檳榔單作、香露兜單作和檳榔間作香露兜處理的土壤含水量分別為62.66%、65.08%和53.58%，3種種植模式間的土壤含水量不存在顯著差異。檳榔間作香露兜后土壤有機質含量顯著低于檳榔單作27.70%，略高于香露兜單作處理；檳榔間作香露兜后土壤全氮含量較檳榔單作顯著降低18.79%；土壤全磷相較檳榔和香露兜單作分別減少29.69%和18.92%；檳榔間作香露兜后土壤全鉀與檳榔單作相比降低42.77%，與香露兜單作相比降低24.53%。由此可知，檳榔間作香露兜后土壤養分含量降低，土壤逐漸趨于酸性且土壤中鹽離子濃度提高，大部分養分指標均相較檳榔單作顯著下降，可能與檳榔和香露兜對土壤養分的吸收作用加強有關。

表1 不同種植模式對土壤理化性狀及養分含量的影響

2.2 不同種植模式對土壤細菌多樣性指數的影響

3種種植模式下土壤中細菌群落組成可分為42門143綱309目470科832屬1743種6121個OTUs；香露兜單作模式下可分為40門128綱266目395科647屬1262種3722個OTUs；檳榔間作香露兜模式下可分為37門113綱216目317科504屬924種及2263個OTUs；檳榔單作下可分為可分為39門122綱267目403科692屬1401種4292個OTUs(表2)。與檳榔單作與香露兜單作相比，檳榔間作香露兜模式下細菌群落組成各分類水平(種、屬、科、目、綱、門)的數量均呈明顯降低趨勢。

表2 不同種植模式下土壤細菌群落組成的比較

在土壤微生物群落評估中，ACE、Chao1和Shannon等多樣性指數已廣泛應用于表示土壤細菌群落物種總數、物種豐富度及多樣性指數。通過OTU數量計算不同種植模式下細菌群落豐富度和多樣性，結果發現，在3種種植模式中，檳榔間作香露兜的土壤細菌ACE指數較香露兜單作和檳榔單作2種單作模式均顯著降低，分別由3326.43和3907.50降低至2009.33，降低39.60%和48.58%；檳榔間作香露兜后細菌Chao1指數較香露兜單作和檳榔單作也顯著降低，由3327.42和3879.88降低至1931.52，分別降低41.95%和50.22%；檳榔間作香露兜后土壤細菌Shannon指數顯著低于檳榔單作和香露兜單作，由6.08和6.28降低至5.20(表3)。上述結果表明，間作后細菌多樣性指數顯著低于檳榔單作及香露兜單作的細菌多樣性指數。因此，間作模式不利于土壤細菌多樣性的維持。

表3 不同種植模式下土壤細菌多樣性指數的比較

2.3 不同種植模式對土壤細菌群落結構的影響

通過對所有土壤樣品進行測序發現，細菌群落OTU數共有427 541個序列。每個樣本的細菌序列數量為43 986～54 175(平均值為47 505)。細菌群落門類水平相對豐度大于1%的菌門有12個，分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Actinobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)、粘球菌門(Myxococcota)、Methylomirabilota、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、未知細菌、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、浮霉菌門(Planctomycetota)，對應的相對豐度分別為20.23%、20.09%、19.67%、15.61%、6.39%、3.27%、2.91%、1.96%、1.69%、1.30%、1.22%、1.15%，其他門類為4.51%(圖1)。其中，變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門是所有細菌群落中的優勢菌門，在3種種植模式下以上四類菌門的相對豐度之和大于66.10%，單一菌門豐度分別為20.23%、15.61%、19.67%和20.23%，均大于15.00%。檳榔間作香露兜后，變形菌門的細菌序列數量由香露兜單作時的11 527.33顯著降低為7219.00；綠彎菌門的細菌序列數量由檳榔單作時的3893.67顯著提高至19 088.33；而放線菌門及酸桿菌門的細菌序列數量均有所下降(表4)。檳榔單作與香露兜單作的細菌群落結構相似，而檳榔間作香露兜后變形菌門、放線菌門、酸桿菌門豐度均出現降低，綠彎菌門豐度則提高。檳榔間作香露兜后土壤養分含量的降低和微環境的變化，可能是導致富營養型細菌(如變形菌門)豐度減少，寡營養型細菌(如綠彎菌門)增加的主要原因。放線菌門的主要功能促使土壤中的動物和植物遺骸腐爛，并且產生農用抗菌素和維生素等，而酸桿菌門同樣有降解土壤有機質的作用。因此，檳榔間作香露兜后放線菌門和酸桿菌門數量的減少可能與間作增加作物根系生物量、降低根系周轉率有關。上述結果表明，在間作香露兜后土壤細菌群落結構變化對改善檳榔園土壤細菌群落結構具有積極意義。

表4 不同種植模式下優勢菌門的細菌序列數量

圖1 不同種植模式下土壤細菌群落在門分類水平下的組成及相對豐度

2.4 環境因子對土壤細菌群落多樣性及結構的影響

采用冗余分析(RDA)進一步分析各土壤環境因子與細菌多樣性指數間的關系。圖2-a為細菌多樣性指數與土壤理化性質間的關系，蒙特卡羅置換檢驗結果(表5)表明，土壤電導率(F=28.50，P=0.002)和pH(F=3.60，P= 0.014)是細菌群落多樣性指數變異的主要貢獻者。電導率、pH、有機質、容重、全磷、全氮、全鉀及土壤含水量共同解釋了樣本間細菌群落變異的75.58%。RDA分析的前2個排序軸分別解釋了總方差的55.10%和20.48%。環境因子對細菌多樣性指數的影響排序為電導率>pH>有機質>容重>全磷>全氮>全鉀>土壤含水量。分析發現ACE指數、Chao1指數和Shannon指數與pH呈顯著正相關，與土壤電導率呈顯著負相關。圖2-b為細菌菌門與土壤理化性質間的關系，土壤全磷(F=49.10，P=0.002)和土壤容重(F=7.50，P=0.034)是細菌菌門產生變異的主要貢獻者。所有的環境變量共同解釋了樣本間細菌群落變異的91.43%，RDA分析的前2個排序軸分別解釋總方差的83.04%和8.39%，很好地解釋了環境因子對細菌主要菌門的影響。環境因子對細菌優勢菌門的影響順序為全磷>容重>電導率>全鉀>全氮>有機質>pH>土壤含水量。

表5 環境因子對土壤細菌的貢獻及其顯著性分析

圖2 土壤細菌多樣性指數(a)、細菌群落(b)與土壤理化特性的冗余分析

相關分析結果(表6)表明，土壤理化性質顯著影響細菌群落組成。在優勢細菌門中，變形菌門相對豐度與有機質呈顯著負相關；放線菌門相對豐度與土壤容重呈顯著正相關；綠彎菌門相對豐度與電導率和有機質呈極顯著正相關(P<0.01，下同)，與全磷呈極顯著負相關，與全鉀呈顯著負相關；厚壁菌門相對豐度與pH和容重呈顯著正相關，與全氮呈極顯著正相關；粘球菌門和脫硫菌門(Desulfobacterota)相對豐度與電導率呈極顯著負相關；粘球菌門相對豐度與有機質呈顯著負相關，與全磷呈顯著正相關，與全鉀呈極顯著正相關；脫硫菌門相對豐度與pH和容重呈顯著正相關，與全磷和全鉀呈極顯著正相關。在檳榔間作香露兜體系中主導土壤細菌優勢菌門變化的主要因子分別為有機質、土壤容重和土壤磷含量。結合環境因子對土壤細菌群落多樣性的影響因子，本研究明確土壤容重和總磷是調控細菌區系結構和優勢菌群的主要環境因子，但土壤有機質含量的變化對土壤細菌區系的調控作用同樣不容忽視。

表6 門分類水平下土壤細菌的群落組成與土壤理化性質的相關系數

3 討 論

3.1 檳榔間作香露兜對土壤理化性質的影響

pH是反映土壤性質的重要指標，也是影響作物生長和土壤健康程度的重要因素[19]。本研究中，檳榔間作香露兜模式較檳榔單作土壤pH顯著降低，可能與間作后土壤中的根生物量增加，根系分解后產生的有機物輸入增加導致分解過程中有機酸含量提高有關，與前人對毛竹/景田及甘蔗/花生間作體系中的研究結果[20-21]一致。已有研究表明，間作后根系數量及根系殘體分解量增加會導致土壤有機質含量增加，但本研究中土壤中有機質含量降低可能是由于間作后2種作物對土壤養分吸收增加，但未及時對土壤肥力進行補充所致[22]。李波等[23]研究表明，間作后作物根系對不同土層產生影響，使間作后土壤容重高于單作。容重改變的原因可能與有機質分解導致團聚體結構破壞為小分子結構有關[24]。土壤電導率是反映土壤中電解質濃度的指標，同時表征土壤鹽離子濃度的指標，在適宜的范圍內，土壤電導率越高表明土壤中可供植物利用的速效養分越多[25]。間作后土壤中的水分含量不變而電導率增加，可能是土壤的儲水能力減弱，致使鹽離子的聚集作用增加[26]，本研究中檳榔間作香露兜后土壤電導率上升也證實這一觀點。土壤中全氮、全磷、全鉀含量下降可能是由于間作提高了單位面積內作物對土壤養分的吸收量，2種作物在生長過程中需要不斷從土壤中汲取相對于單作時更多養分，降低土壤中的養分儲備[27]。

3.2 檳榔間作香露兜對土壤細菌多樣性指數的影響

土壤細菌群落在土壤結構形成、有機物分解、養分轉化和循環等方面發揮重要作用，與土壤性質關系緊密，常被視為用于評價土壤健康的生物學特性指標[28-29]。土壤微生物對外界環境變化極為敏感，其數量和種類受土壤環境和土壤耕作措施的影響，如pH、含水量、環境溫度和土壤養分等因素均能造成變化[30]。細菌多樣性指數是表征群落多樣性的常用指數，能揭示土壤細菌種類和功能的差異[31]。竹蓀間作橡膠[32]以及甘蔗間作玉米[33]后發現土壤微生物Shannon指數均顯著增加，可能是間作模式下土壤微生物對碳源的利用率提高。其中，引起細菌群落多樣性指數顯著降低最主要的環境因子是土壤pH。在酸性土壤中，土壤微生物的生長活性隨著pH降低而下降[34]，根系分泌物的種類及含量尤其是有機酸類等物質改變導致的pH降低影響了土壤細菌的生長環境[35]。本研究中，ACE、Chao1和Shannon指數在檳榔間作香露兜后出現了不同程度的降低，說明間作改變了土壤中細菌的多樣性和豐富度，究其原因可能是間作后作物的根系數量、結構及物種變化引起根系分泌物種類及含量改變，致使間作體系對養分利用方式改變，從而導致土壤細菌多樣性的變化。

3.3 檳榔間作香露兜對土壤細菌群落結構的影響

檳榔間作香露兜后，土壤全磷和土壤容重的變化顯著影響土壤細菌群落組成而使其產生差異，是細菌群落結構發生改變的主要原因。而相對豐度大于15.00%的四類土壤細菌優勢菌門對環境因子的變化產生了不同程度的響應，其中變形菌門、放線菌門和酸桿菌門在間作后其相對豐度均出現顯著降低，而綠彎菌門在間作后相對豐度顯著升高。變形菌門在本研究采用的3種種植模式下均為相對豐度最高的菌門，與前人對土壤微生物豐度方面的研究[36]類似。全氮與變形菌門呈正相關，可能是大多數來自變形門的菌群具有固氮作用，間作后土壤中全氮含量下降導致變形菌門相對豐度下降[37]。此外，放線菌門在有機質降解過程中，會產生相關酶以加速有機質的有效降解與本研究中間作后有機質含量降低的結論保持一致[38]。酸桿菌門是一種寡營養細菌，參與有機物分解及微生態環境的平衡體系，可降解木質素和纖維素，提高土壤養分含量[39]。一般來說，酸桿菌門適合在pH較低的環境下生長，但本研究中土壤pH降低后，酸桿菌門相對豐度降低可能與土壤中的全量養分含量下降，導致酸桿菌門豐度下降的效應掩蓋了土壤pH變化對酸桿菌門相對豐度的影響[36]。綠彎菌門在好氧環境下生存繁殖，有利于土壤中有毒有害物質的降解[40]，在間作后相對豐度顯著提高，說明間作后土壤中的有毒有害物質積累減弱，對土壤健康有益[41]。

4 結 論

檳榔林下間作香露兜不影響細菌OTU總數，但通過降低pH及提高電導率而顯著降低土壤細菌群落多樣性指數；間作模式通過提高土壤容重降低全磷、全鉀及有機質含量，而降低變形菌門、放線菌門和酸桿菌門的豐度，卻提高了綠彎菌門的豐度。可見，盡管檳榔間作香露兜體系顯著降低土壤養分含量，但能改善檳榔林原位土壤細菌區系的豐度及多樣性，對維持檳榔林土壤健康及促進檳榔與香露兜相關產業發展具有積極意義。