不同飼養方式下蘇尼特羊肌纖維組成和羊肉品質的比較研究

孫 冰，侯艷茹，徐麗媛，王晨蕾，靳 燁，趙麗華，圖 雅，蘇 琳,

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏銀川 750021；3.烏拉特中旗農牧和科技局，內蒙古烏拉特中旗 015300）

羊肉以富含優質蛋白質、礦物元素（如鐵和鋅）、肉質細嫩等特點而深受廣大消費者青睞。羊肉的消費量不斷攀升，并且養羊業由于投入資金量少、育肥周期短、經濟效益顯著的特點，已成為國內外畜牧業發展的重要組成部分[1]。目前，肉羊傳統放牧方式一方面由于禁牧、限牧政策的實施以及集約化的生產要求，另一方面草原上的牧草質量、產量隨季節的交替而波動，且四季營養不均衡，飼用價值、產草量降低，這些都是導致放牧羊的采食量下降、營養攝入不足的原因，因此需要通過舍飼和補飼的方式來實現肉羊的營養均衡，不同的飼養方式直接影響肉羊的生長性能及肉品質等特性[2]。肌纖維是骨骼肌的基本組成單位，伴隨著動物的出生，其數量就已確定，但其類型之間可以互相轉化，遵循Ⅰ型?Ⅱa ?Ⅱx/d ?Ⅱb 的順序，其生物學特性（密度、橫截面積及類型分布等）都是影響肉品質的重要因素[3]。

有研究指出，放牧羊補飼含有大麥、玉米、豆粕、維生素添加劑和礦物元素的精料時，羊肉的氧化穩定性、營養價值和風味物質均有顯著性的提高[4]。尹麗卿[5]對比了放牧和圈養兩種飼養方式下蘇尼特羊三個部位（臂三頭肌、股二頭肌、背最長肌）的肌纖維類型分布，發現圈養羊的酵解型肌纖維含量在三個部位中均高于放牧條件下的。以上結論說明飼養方式對反芻動物的肉品質和肌纖維類型的分布均有影響。增加肌肉中的Ⅰ型和Ⅱa 型肌纖維的占比，肉質也就越細嫩[6]。降低肌肉中Ⅱx 型和Ⅱb 型纖維的占比，能使宰后豬肉pH 下降速度減慢，改善肉品質[7]。

目前針對三種飼養方式間蘇尼特羊胴體品質、屠宰性能及肌纖維生物學特性的全面研究較少，因此本研究以蘇尼特羊為研究對象，分析放牧、放牧+補飼和舍飼三種飼養方式下肉品質指標，之后通過ATPase 染色法和MyHC mRNA 表達量的測定對肌纖維類型進行定性和定量的劃分，對肌肉重要代謝酶活力進行比較，旨在探究不同飼養方式間蘇尼特羊屠宰性能、肉品質及肌纖維特性的差異性，為日后通過改變飼養方式進而改善肉品品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

30 只蘇尼特羊 在內蒙古烏拉特中旗哈拉圖嘎查順遂牧區飼養，在草原恒通食品有限公司進行屠宰，宰后 1 h 內取蘇尼特羊背最長肌為實驗材料。本實驗中飼喂舍飼和放牧+補飼的蘇尼特羊基礎日糧組成及營養水平見表1；青貯飼料、葵花餅 牧民自制；精飼料 恒牧飼料科技有限公司；異戊烷 阿法埃莎（天津）化學有限公司；巴比妥鈉 山東西亞化學股份有限公司；三磷酸腺苷二鈉鹽（ATP） 北京酷來搏科技有限公司；無水乙酸鈉、無水氯化鈣 國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈷 天津市福晨化學試劑廠；異丙醇 上海振興化工二廠有限公司；硫化銨上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑均為分析純。RNAiso Plus、TB GreenTM Premix Ex TaqTM II、PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒 大連寶生物工程大連有限公司；蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶試劑盒 南京建成生物工程研究所。

表1 試驗羊日基礎飼糧組成及營養水平（%）Table 1 Basic diet composition and nutritional levels (%)

Leica 4000B 顯微鏡 德國徠卡公司；MEV 冰凍切片機 德國 Slee 公司；Eppendorf 5417 冷凍離心機 德國Eppendorf 生物公司；DSH-300A 回旋式水浴恒溫振蕩器 上海雅榮生化設備儀器有限公司；凝膠成像分析系統 美國 Bio-Rad 公司；LightCycler?96 實時熒光定量 PCR 儀 羅氏診斷產品（上海）有限公司；YNERGY H1 型酶標儀 美國 Bio-Tek Instruments 公司；Biometra PCR 擴增儀 北京北方華奧貿易有限責任公司；C-LM3B 型數顯式肌肉嫩度儀 東北農業大學工程學院；STC-P2A 全自動測色色差計 上海生物生化實驗儀器公司；pH-STAR型胴體 pH 值直測儀 德國 Matthaus。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物的飼養管理 本實驗所有實驗動物于2018 年6 月~9 月在內蒙古烏拉特中旗哈拉圖嘎查順遂牧區飼養，選取體質量為（17.16±3.33）kg 的3 月齡蘇尼特羊30 只，設置為舍飼（C）、放牧+補飼（S）、放牧（P）三個組別，每組10 只，飼喂期間自由飲水。預實驗期7 d，實驗期90 d。屠宰前試驗羊禁食24 h、停水2 h，依照穆斯林阿訇屠宰要求屠宰30 只蘇尼特羊。 舍飼組日糧：精飼料（10 kg）、青貯飼料（8 kg）和葵花餅（5 kg），并且每月依次增加精飼料（2 kg）、青貯飼料（8 kg）和葵花餅（5 kg）；放牧+補飼組日糧：飼料種類和重量與舍飼組一樣；放牧組日糧：自由放養，主要食用芨芨草，石針茅等牧草，不飼喂其它飼料。

1.2.2 屠宰性能和胴體品質的測定 屠宰性能的測定：分組前重指飼養管理開始前所有試驗羊的體重；宰前活重指試驗羊屠宰前禁食禁水后的體質量；總增重量指飼養管理到宰前這期間試驗羊體重的增長量；棒骨、脊骨、肋骨重量指胴體剔除每一部分的肉后，肋骨、棒骨、脊骨分別稱重；凈肉重量指剔除骨頭后試驗羊胴體所剩余的凈肉質量；凈肉率（%）=凈肉重量/活體重量×100；屠宰率（%）=胴體重量/活體重量×100；胴體產肉率（%）=凈肉重量/胴體重量×100；骨肉比（%）=骨重量/凈肉重量×100。

胴體品質的測定：胴體重量指試驗羊屠宰放血后，去除頭、尾、四肢、淋巴、內臟、皮毛，胴體靜置30 min 后重量；胴體長將試驗羊胴體倒掛，測得的恥骨聯合前緣到第一頸椎前緣之間的長度；胴體寬是試驗羊肋骨末端到脊骨之間測得的距離；背膘厚指試驗羊背部脂肪的厚度。

1.2.3 羊肉品質指標測定 在羊屠宰后取左半胴體背最長肌（longissimus doris muscle，LD）對各項肉品質指標進行測定。使用全自動色差儀測定肌肉色澤，a*值表示紅綠度、b*值表示黃藍度、L*值表示亮度；參照侯普馨等[8]論文中的方法計算肌肉蒸煮損失；使用pH-STAR 型胴體直測式pH 計最初pH（pH45min），靜置排酸24 h 后測得的pH 記為pH24h；CLM-3 型嫩度儀測定肌肉剪切力，每次測定重復6~8 次。

1.2.4 組織學特性測定 試驗羊屠宰后45 min 內，順沿肌纖維方向將肌肉切割，用刀片修整為體積約為0.5 cm×0.5 cm×1 cm 的塊狀，放進異戊烷（需提前經液氮預冷）中脫水干燥30 s，觀察到肉塊顏色完全脫水發白后投入液氮中，存放在無酶無菌凍存管中，?80 ℃的條件下長期保存。用于后續肌纖維組織的冰凍切片。

按照上述方法采集好的樣品置于?25 ℃冰凍切片機中包埋并冷凍，將其切成10 μm 厚的橫斷面[9]，組織切片通過ATP 酶組織化學染色法[10]進行染色，染好的組織切片在Leica 4000B 熒光倒置顯微鏡10×10 倍下觀察，選擇2~4 個分型清晰的視野，通過Leica Qwin V4.4 彩圖軟件分析肌纖維的密度、直徑、橫截面積、數量比例和面積比例[11]。

1.2.5 基因表達量的測定

1.2.5.1 樣品采集 取80~100 mg 背最長肌肌肉塊保存?80 ℃的冰箱中，用于后續實驗總RNA 的提取。

1.2.5.2 RNA 提取與反轉錄 利用實驗室傳統的Trizol 抽提法，按照RNAiso Plus 的指導書提取肌肉中總RNA[12]。總RNA 濃度和純度（A260nm/A280nm）用微量分光光度計和核酸蛋白分析儀測定。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并用凝膠成像系統曝光拍照以驗證實驗中提取好的總RNA 是否完整。反轉錄參照說明書進行，將合成的質量濃度為50 ng/μL 的cDNA 稀釋到10 ng/μL 用于后續實驗基因表達量的測定[13]。

秀容川的瞳孔再次變成赤金色，這是他的一門秘術：小滿瞳。施展小滿瞳后，目光就成了兵器，就是一只螞蟻，呈現在小滿瞳中，也如大象一般巨大。

1.2.5.3 引物序列及合成 實驗所需MyHCs 基因序列引自尹麗卿、馬曉冰論文[5，14]，其他基因序列利用NCBI 網站設計，本實驗中所有基因序列由生工生物公司（上海）合成，詳細序列見表2 所示。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2.5.4 實時熒光定量PCR 擴增 以cDNA 為模板，使用定量試劑盒（TB GreenTM Premix Ex TaqTM II），以GAPDH 為管家基因，對實驗中多個目的基因進行實時熒光定量分析。PCR 反應條件為：預變性：95 ℃，30 s；變性：95 ℃，5 s；退火：58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；變性、退火、延伸三個過程進行45 個循環；延伸72 ℃，10 min。采用2?ΔΔCt法對數據進行處理。

1.2.6 酶活力測定 蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶活性均按照南京建成測試盒附帶說明書進行。

1.3 數據處理

所需實驗數據用SPSS25.0 進行統計學分析，分析結果全部用平均值±標準差表示。實驗結果用單因素方差法進行差異性分析。P>0.05 表示組間差異不顯著，P＜0.01 表示組間差異極顯著，P＜0.05 表示組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 三種飼養方式下蘇尼特羊屠宰性能和胴體品質的差異比較

由表3 可知。放牧組和放牧+補飼組宰前活重量顯著低于舍飼組（P＜0.05）；放牧組總增重量、凈肉重、凈肉率、產肉率、屠宰率、胴體重、背膘厚顯著低于放牧+補飼組和舍飼組（P＜0.05），脊骨重量和胴體長顯著低于舍飼組（P＜0.05），骨肉比顯著高于放牧+補飼組和舍飼組（P＜0.05）。

表3 三種飼養方式下蘇尼特羊屠宰性能和胴體品質的差異比較Table 3 Differences in slaughter performance and carcass quality of Sunit sheep under three typical feeding patterns

屠宰性能和胴體品質主要受遺傳、環境、性別、飼料和飼養管理等多方面因素的共同影響，在相同條件下飼糧是影響的主要因素。本實驗結果顯示，舍飼和放牧補充精料的方式都能夠不同程度的提高蘇尼特羊宰前總增重量、屠宰率、凈肉率等指標。解進等[15]指出，在育肥期結束時，與傳統的放牧方式相比，放牧后補飼精料的方式能夠使呼倫貝爾羔羊的凈肉質量、胴體質量、屠宰率、凈肉率均有不同水平的積極影響，其中凈肉質量最高可提高40.55%。Turner等[16]研究指出，與自然放牧方式下相比，放牧并補充全棉籽的方式會顯著提高薩福克羔羊的胴體質量和肋骨面積。全舍飼的飼養方式可使得崗巴羊的宰前活體重量和平均日增重均顯著高于純自然放放牧和放牧后補充精料的方式[17]。王宏博等[18]報道，補飼的季節對于羔羊的生長性能也有一定的影響，在夏季給放牧羊補充精料的飼養方式能使得羔羊的宰前活體質量、胴體凈肉質量、屠宰率等都優于純放牧方式。以上結果說明舍飼和放牧+補飼對肉羊的屠宰性能有積極的改善作用，但對于各指標具有不同的效果。

2.2 三種飼養方式下蘇尼特羊羊肉品質的差異比較

表4 三種飼養方式下蘇尼特羊肉品質的差異比較Table 4 Differences in mutton quality of Sunit sheep under three typical feeding patterns

肉色作為評價肉品質的最直觀指標，其中其關鍵作用的物質是肌紅蛋白，肌肉色澤的差異主要是由于不同類型肌纖維中的肌紅蛋白的含量有所不同所導致。因為氧化型（Ⅰ型+Ⅱa）肌纖維中肌紅蛋白含量較高，所以氧化型肌纖維比例高的肌肉呈現的肉色愈加鮮紅。本實驗中放牧和放牧+補飼的蘇尼特羊在L*優于舍飼組，三組間a*、b*值沒有顯著差異（P>0.05）。與此一致，王敏研究指出，放牧和舍飼兩種飼養模式下肉牛的色澤并沒有顯著的差異性[19]。但是也有研究表明放牧羊L*和a*值顯著高于舍飼方式下的[20]。飼養管理、肌肉部位、品種以及屠宰方式的差異都是影響畜禽胴體肉色的因素。pH 可以反映試驗動物屠宰后肌肉糖原酵解水平和速率。剛屠宰后動物的肌肉pH 范圍是 6.0~7.0，肌肉pH 的下降速度過快一方面會破壞水與蛋白質二者的結合，另一方面會影響肌肉組織的蛋白特性，進而對多項肉品質指標產生不利影響[21]。本實驗中所有蘇尼特羊屠宰后肌肉的pH0均處于正常區間，而冷庫靜置排酸24 h 后，結果卻顯示為放牧組和放牧+補飼組顯著小于舍飼組（P＜0.05），這極有可能是因為pH 下降速率和回升速率快，加快了肉的成熟速度。肉質嫩度與剪切力呈負相關，剪切力值的大小可以直接反映肉質是否足夠鮮嫩[22]。本研究中得出的結果說明放牧和放牧+補飼方式下飼養的羊肉嫩度要優于舍飼方式下的，與此結果一致，有研究表明與放牧+補飼和全舍飼方式下飼養的崗巴羊相比較，純自然放牧條件下的羊肉更加細嫩[17]。De 等[23]研究指出，在不同放牧方式下飼養的羔羊肉剪切力值沒有顯著差異。放牧+補飼條件下，絨山羊母羔肉質較羯羔嫩且新鮮，營養價值更高[24]。這可能是由于基礎日糧營養水平、動物飼養管理、性別和品種等多種因素的不同而引起的差異。

肌纖維直徑的大小、類型的分布以及各型纖維的數量占比均與羊肉品質緊密相關，因此，本實驗對肌纖維的組織學特性進行了測定，以期從肌纖維角度探尋三種飼養方式下肉品質差異性的原因。

2.3 三種飼養方式下蘇尼特羊肌纖維特性的差異比較

2.3.1 蘇尼特羊背最長肌的 ATP 酶染色結果 如圖1所示，在10×10 倍顯微鏡下觀察到肌纖維排列緊密、輪廓清晰且分型明顯。因為不同類型肌纖維內的ATP 酶對酸和堿的穩定性有所差異，可將其劃分成三種類型，Ⅰ型（慢速氧化型）肌纖維在pH4.60條件下的ATPase 活性最強，呈黑色；Ⅱa 型（快速氧化-酵解型）肌纖維的ATPase 在pH4.60 條件下受到抑制，無法參與染色反應，呈白色；Ⅱb 型（快速酵解型）肌纖維在pH4.60 條件下具有一定的ATPase 活性，顏色呈棕褐色[25]。

圖1 三種飼養方式下的蘇尼特羊背最長肌 ATPase 染色結果Fig.1 ATPase staining results of LD of Sunit sheep under three feeding patterns注： S：放牧+補飼組；P：放牧組；C：舍飼組。

2.3.2 放牧、放牧+補飼和舍飼三種飼養方式下蘇尼特羊肌纖維特性的差異比較 根據表5 可知，相比于舍飼組，放牧+補飼組Ⅱa 型肌纖維面積和數量比例顯著升高（P＜0.05），肌纖維密度顯著增加（P＜0.05），Ⅱb 型肌纖維直徑和面積比例顯著降低（P＜0.05）；放牧組Ⅱa 型肌纖維面積和數量比例顯著增加（P＜0.05），肌纖維密度顯著增加（P＜0.01），Ⅱb 型肌纖維直徑、面積和數量比例顯著降低（P＜0.05），Ⅱb 型橫截面積極顯著降低（P＜0.01），Ⅰ型和Ⅱa 型肌纖維的直徑和橫截面積顯著降低（P＜0.05）。放牧+補飼組Ⅱa 型肌纖維直徑和橫截面積顯著高于放牧組（P＜0.05）。

表5 三種飼養方式下肌纖維組織學特性的差異Table 5 Differences of muscle fiber characteristics under three typical feeding patterns

在三組蘇尼特羊的背最長肌肌纖維組成中，均是Ⅱ型肌纖維所占比例較大（80%以上），Ⅰ型肌纖維是占比最小的，放牧、放牧+補飼和舍飼三種飼養方式之間肌纖維組織學特性指標差異相對較大。放牧組氧化型（Ⅰ型+Ⅱa 型）肌纖維的數量比例、面積比例分別是48.65%、49.29%，放牧+補飼組分別為45.01%、46.81%，舍飼組分別為42.75%、41.30%。在三種典型飼養方式下，放牧羊肌纖維密度最大，并且各型的肌纖維直徑和橫截面積都小于舍飼和放牧后補充精料方式下的。以上結果說明，與舍飼方式下的蘇尼特羊相比，放牧和放牧+補飼方式能夠上調肌肉中氧化型肌纖維的比例，直徑和橫截面積有效減小。侯艷茹也用ATPase 染色法對肌纖維進行了分型，得出圈養條件下蘇尼特羊背最長肌的氧化型（Ⅰ型+Ⅱa 型）肌纖維比例不及放牧方式下的高[25]。

2.4 三種飼養方式下蘇尼特羊MyHC mRNA 相對表達量的差異比較

由圖2 可知，舍飼羊背最長肌的MyHCⅠmRNA相對表達量顯著低于放牧羊和放牧+補飼羊（P＜0.05），MyHCⅡbmRNA 相對表達量顯著高于放牧羊和放牧+補飼羊（P＜0.05）；放牧羊MyHCⅡa、MyHCⅡxmRNA 相對表達量顯著高于放牧+補飼羊和舍飼羊（P＜0.05）。

圖2 三種飼養方式下MyHC mRNA 相對表達量的差異Fig.2 Differences of MyHC mRNA relative expression under three typical feeding patterns注：不同小寫字母表示同一指標不用飼養方式下差異顯著P＜0.05，圖3 同。

依據MyHCs 差異表達的分子分型法比組織化學染色法能更為準確的對肌纖維類型進行劃分，可分為MyHCⅠ、Ⅱa、Ⅱb和Ⅱx型4 類亞基，據此將肌纖維分為Ⅰ型（慢速氧化型）、Ⅱa 型（快速氧化型）、Ⅱx 型（中間型）和Ⅱb 型（快速酵解型）[3]。本實驗對ATPase 組化染色的結果進行分析，得出舍飼組酵解型肌纖維比例最高，氧化型肌纖維的比例最低，而放牧組與此相反。MyHCmRNA 表達量測定的結果與ATPase 染色法結果基本是一致的。肌肉的剪切力值與肌纖維直徑和橫截面積呈顯著正相關[26?27]，王莉關于牦牛嫩度與肌纖維類型分布之間的關系上的研究得出，肌肉中氧化型肌纖維分布越廣，肌肉中的嫩度也就越好[28]。本實驗結果顯示，三種飼養方式中各型肌纖維直徑和橫截面積的趨勢為舍飼組>放牧+補飼組>放牧組，且舍飼羊酵解型肌纖維比例相較放牧和放牧補飼方式下的蘇尼特羊較高，氧化型纖維比例低，所以全舍飼羊肉的嫩度不及放牧和放牧+補飼羊。pH0的差異性表現為放牧組高于舍飼組，放牧+補飼組與舍飼組無差異，在排酸24 h 后，放牧組和放牧+補飼組pH24h小于舍飼組，這可能是由于舍飼羊肌肉中的酵解型肌纖維比例較高，酵解型肌纖維中因為糖原含量豐富，糖酵解潛力高，所以在宰后加速了糖酵解速率，使得pH 下降和回升速率快，最終加快了肉的成熟速度。侯普馨[26]在對蘇尼特羊的肉品質研究中指出，pH24h與Ⅰ型肌纖維的比例存在顯著負相關關系，與本實驗結論相一致。肌纖維的分析結果與不同飼養方式下肉品質分析結果大體吻合，因此，舍飼、放牧+補飼和放牧三種飼養方式下羊肉品質存在差異的內在原因極可能是肌肉中肌纖維特性不同而造成的。

2.5 三種飼養方式下蘇尼特羊MDH、LDH、SDH 活力的差異比較

據圖3 可知，放牧組和放牧+補飼組背最長肌MDH 活力顯著高于舍飼組（P＜0.05），放牧組LDH活力極顯著低于舍飼組和放牧+補飼組（P＜0.01），放牧組SDH 活力極顯著高于舍飼組和放牧+補飼組（P＜0.01）。

圖3 三種飼養方式下蘇尼特羊代謝酶活力的差異Fig.3 Differences of metabolic enzyme activity under three typical feeding patterns

肌纖維類型組成與肌肉相關代謝酶密切相關，因此本試驗檢測了LDH、MDH 和SDH 活力。氧化型肌纖維為骨骼肌提供能量的主要途徑是有氧氧化，因此SDH、MDH 等有氧代謝酶系活力很高，肌肉氧化代謝能力與酶活力成正相關關系[29]。酵解型肌纖維主要的能量供應途徑是無氧酵解，LDH 等酵解酶系活力高低可以反映機體細胞無氧酵解過程的活躍情況[30]。本實驗結果進一步說明舍飼的方式提高了肌肉的酵解代謝酶活力，降低了氧化代謝酶活力，而放牧和放牧+補飼的方式下都能不同程度的提高肌肉的氧化代謝酶活力，降低酵解代謝酶活力，這個結果與舍飼方式下酵解型肌纖維比例高、氧化型肌纖維比例低這一結果是一致的。

3 結論

與純自然放牧方式相比，舍飼和放牧后補充精料方式下的蘇尼特羊凈肉質量、胴體質量、凈肉率、屠宰率等多項屠宰性能和胴體品質指標有不同水平的提高，這說明舍飼方式和放牧后補充精料對改善蘇尼特羊的生長性能有積極作用。同時舍飼組酵解型肌纖維比例最高，放牧組、放牧+補飼組氧化型肌纖維比例較高。此外，放牧方式增強了氧化代謝酶SDH 活力，降低了酵解代謝酶LDH 活力。即放牧和放牧補充精料的飼養方式均能夠增強機體氧化代謝能力，上調氧化型肌纖維比例，提高肉的嫩度，延長肉的成熟時間。

綜上，本研究的結果表明純自然放牧方式下的蘇尼特羊屠宰性能和胴體品質方面不及舍飼和放牧+補飼方式，本研究的實驗結論為今后在調整飼養方式方面，如通過控制舍飼羊的運動量和飼糧角度提升羊肉品質建立了理論依據。

此外，本研究對于三種飼養方式間肉品質和肌纖維的差異只進行了初步實驗，影響肌纖維特性變化的通路十分復雜，受到多種因素的共同作用，需要進一步結合細胞、分子實驗找出調控肌纖維特性的關鍵因子。