整合素α 5與卵巢上皮性癌鉑類耐藥SKOV3/DDP細胞增殖、侵襲和凋亡的相關研究*

韋露薇，陳國偉，莫婧，梁慧英，李力

545001 廣西 柳州，柳州市工人醫院 婦科(韋露薇、陳國偉、莫婧、梁慧英);530021 南寧，廣西醫科大學附屬腫瘤醫院 婦科(李力)

卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，是一種具有復雜分子和遺傳變異的異質性疾病，患者死亡率高居各類婦科腫瘤的首位[1]。目前鉑類結合紫杉醇類的聯合化療是卵巢癌的一線化療方案，盡管大多數患者初期會獲得良好的化療效果，但部分患者在治療后18 月內出現復發或轉移[2]，多藥耐藥出現是導致卵巢癌治療后復發、轉移甚至死亡的重要原因，亦是嚴重制約卵巢癌患者生存率提高的瓶頸問題[3]。因此，探討卵巢癌多藥耐藥的分子機制，尋找逆轉化療耐藥的靶標，對改善卵巢癌治療意義重大。我們前期通過綜合生物信息學分析來篩選上皮性卵巢癌多藥耐藥發生過程中調控信號傳導通路的關鍵基因發現，整合素α5(integrin α5，ITGA5)做為信號通路上游效應分子，在卵巢上皮性癌耐藥過程中，通過抑制凋亡、影響下游信號通路的傳導參與耐藥過程[4]。因此，本研究通過深入探討ITGA5在卵巢癌鉑類耐藥SKOV3/DDP細胞增殖、侵襲及凋亡中的作用，從而為卵巢上皮性癌鉑類耐藥治療尋找相關靶點，為逆轉鉑類耐藥提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑耗材

本實驗所用的SKOV3細胞株存儲于本實驗室中[5]，SKOV3/DDP耐藥株為本實驗室自行建立，由親本細胞SKOV3通過持續暴露于濃度遞增的順鉑中建立而來[6]。其中完全培養基包括1640(Gibco,USA)、10%胎牛血清 (CORNING,USA)，2 μmol/L L-glutamine, 100 U/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin (Gibco BRL,Grand Island,NY)，在5% CO2培養箱中37℃恒溫孵育。LV-ITGA5-RNAi干擾病毒(上海吉凱制藥技術有限公司)、細胞計數試劑盒-8 (CCK-8;Dojindo，熊本，日本)、Transwell相關耗材。

1.2 方法

為研究卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP細胞中ITGA5的表達情況，并探討ITGA5對卵巢上皮性癌鉑類耐藥的影響及可能作用機制，首先采用qRT-PCR檢測卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP細胞中ITGA5表達及差異。將卵巢癌SKOV3/DDP細胞分別分為siITGA5 -SKOV3/DDP組(ITGA5沉默組)、siNC-SKOV3/DDP組(陰性對照組)和SKOV3/DDP組(對照組)，分別轉染ITGA5沉默質粒siITGA5和陰性對照質粒siNC， SKOV3/DDP給予空載體，72小時后驗證轉染情況，并分別用CCK8法檢測增殖活性、半數致死率(50% inhibitory concentration，IC50)、流式細胞術檢測細胞凋亡、Transwell法檢測細胞侵襲能力。

1.2.1 實時定量PCR檢測ITGA5表達情況 采用 RNeasy?Mini Kit(QIAGEN,Germany)試劑盒提取SKOV3、SKOV3/DDP細胞總RNA，采用Thermo RT Kit cDNA (美國,Thermo)將總RNA逆轉錄成cDNA。在ABI7500進行實時定量PCR，實時定量PCR采用試劑One step SYBR primescript plus RT-PCR kit(日本TaKaRa)，反應體系為20 μL。反應條件：95℃預熱10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s進行40個循環。根據基因ITGA5、GAPDH基因的cDNA序列，采用primer7設計引物，引物序列為GAPDH Forward：5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGA-3′；GAPDH Reverse：5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′；ITGA5 Forward：5′-GGCTTCAACTTAGACGCGGAG-3′；ITGA5 Reverse：5′- TGGCTGGTATTAGCCTTGGGT-3′。所有基因引物由TaKaRa生物科技公司合成。目的基因的相對表達量用2ˉ△△Ct法計算，以GAPDH為內參。

1.2.2 慢病毒感染 設計并合成了含有ITGA5表達質粒及其陰性對照(NC)、LV-3、綠色熒光蛋白報告基因的慢病毒包裝。合成的慢病毒包含ITGA5和NC序列(LV3-NC)，用于感染SKOV3/DDP細胞，建立穩定的細胞系。Puro選擇后獲得穩定的細胞，qRT-PCR證實ITGA5表達。

1.2.3 CCK8法檢測細胞IC50、增殖活性 IC50測定：將處于對數生長期的各組細胞制成單細胞懸液，細胞接種于96孔板中12小時后處理，細胞密度為2 000個/孔。將順鉑(0 μg/mL、0.39 μg/mL、0.78 μg/mL、1.56 μg/mL、3.125 μg/mL、6.25 μg/mL)溶解在100 μL DMEM,加入各孔中孵育48 h，CCK8(10 μL)添加和孵化2 h。酶標儀452 nm波長，測定每孔細胞的吸光度值(A)。抑制率=(正常對照孔A值-實驗孔A值)/(正常對照孔A值-空白調零孔A值)×100%，由此計算各組細胞的順鉑抑制率。增殖活性：將處于對數生長期的各組細胞制成單細胞懸液，細胞密度為1.0×103/孔，接種于96孔板中，37℃孵育，其后在第24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h進行實驗指標觀測。按照CCK8說明書操作，酶標儀380 nm波長測定各組細胞的吸光度。計算各組細胞的平均吸光度值，橫坐標為細胞培養時間，縱坐標為細胞吸光值，繪制各時間點的細胞生長曲線。

1.2.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力 收集各組細胞制成單細胞懸液，Transwell上室每孔中加入100 μL細胞懸液，調整細胞濃度為1.5×104個細胞/孔， Transwell下室每孔中加入600 μL 20%FBS DMEM培養基，培養24小時后，多聚甲醛固定后結晶紫染色，顯微鏡下取9個隨機視野下記膜下細胞數平均值。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組細胞配成單個細胞懸液，按每孔含5×105個細胞接種到6孔板, 每種細胞3個重復孔。放置37℃、5%二氧化碳培養箱進行培養24小時后。將順鉑按照4個濃度加入各孔中，即：0 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL。正常對照孔加不含DDP的DMEM培養液 3 mL，放置到恒溫培養箱培養48小時后。于70℃水浴30 s誘導凋亡后，分別加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD，輕柔吹打混勻避光染色15 min。用篩網過濾細胞入流式小管內，在1 h內完成流式細胞儀(激發波長Ex=488 nm)的檢測。

1.3 統計學分析

使用SPSS 21.0統計軟件包，熒光定量PCR實驗結果數據以均數±標準差或中位數表示。計量資料比較用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP中ITGA5表達情況

運用qRT-PCR技術分別對SKOV3及SKOV3/DDP細胞系中ITGA5 mRNA進行驗證，結果顯示，在鉑類耐藥的卵巢癌SKOV3/DDP細胞系中ITGA5相對表達量明顯高于卵巢癌SKOV3細胞系，上調2.03倍，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

圖1 卵巢癌細胞SKOV3及鉑類耐藥細胞SKOV3/DDP中ITGA5表達水平對比(**P<0.01)

2.2 ITGA5基因沉默的效果驗證

轉染72小時后，運用qRT-PCR技術檢測siITGA5-SKOV3/DDP細胞系中ITGA5相對表達量均顯著低于siNC-SKOV3/DDP和SKOV3/DDP組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示ITGA5基因沉默成功。

2.3 ITGA5對siITGA5-SKOV3/DDP細胞IC50的影響

由CCK8實驗可見，實驗組(siITGA5-SKOV3/DDP)、陰性對照組(siNC-SKOV3/DDP)和對照組(SKOV3/DDP)，順鉑的IC50分別為2.096 μg/mL、2.507 μg/mL及2.619 μg/mL，不同組細胞的IC50差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。由此可見，ITGA5表達下調后可一定程度上改善卵巢癌鉑類耐藥細胞SKOV3/DDP的鉑類敏感性。

圖2 三組細胞對順鉑的IC50(**P<0.01)

2.4 ITGA5對siITGA5-SKOV3/DDP細胞增殖的影響

由CCK8實驗可見siRNA-ITGA5感染后的(siITGA5-SKOV3/DDP)細胞增殖能力明顯減弱，siITGA5-SKOV3/DDP 5天后的結果與陰性對照組(siNC-SKOV3/DDP)和對照組(SKOV3/DDP)比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)，而陰性對照組和空白對照組細胞生長速度差別不大。說明siRNA-ITGA5轉染SKOV3 /DDP細胞后能抑制細胞生長。

圖3 轉染siRNA-ITGA5病毒及siRNA-NC后，三組細胞的生長曲線(*P<0.05)

2.5 ITGA5對siITGA5-SKOV3/DDP細胞侵襲的影響

通過檢測Transwell小室下表面的細胞數如圖4所示。結果可見，實驗組細胞(siITGA5-SKOV3/DDP)細胞數明顯減少，與陰性對照組(siNC-SKOV3/DDP)和對照組(SKOV3/DDP)比較，差異有統計學意義(P<0.05)；而空白對照組和陰性對照組細胞數差異無統計學意義(P>0.05)，說明下調ITGA5基因可使卵巢癌SKOV3/DDP細胞侵襲能力明顯減弱。

圖4 三組細胞的侵襲能力比較(**P<0.01)

2.6 ITGA5對siITGA5-SKOV3/DDP細胞凋亡的影響

依據ITGA5下調后基因的siITGA5-SKOV3/DDP(實驗組)的IC50值，以及預實驗摸索，設置3個順鉑濃度為：1.0 μg/mL、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL，且每組均設不加藥的孔作為對照。3個順鉑濃度作用于三組細胞48小時后用流式細胞儀檢測順鉑不同藥物濃度對其凋亡率的影響，結果見圖5。可以看出隨著順鉑濃度的增加，三組細胞中凋亡率都增加；當順鉑藥物濃度達到1 μg/mL時，實驗組細胞(siITGA5 -SKOV3/DDP)與陰性對照組及空白對照組比較，凋亡率顯著上升(P<0.05)，陰性對照組(siNC-SKOV3/DDP)和對照組(SKOV3/DDP)的差別不顯著。

圖5 轉染siRNA-ITGA5病毒及siRNA-NC后，三組細胞的凋亡率比較(**P<0.01)

3 討 論

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤，70%患者就診時已為晚期，發生盆腹腔廣泛轉移，腫瘤細胞發生侵襲、轉移是影響預后的關鍵因素。整合素α(integrin α, ITGA)是一類重要的細胞表面黏附分子，由α/β異構形成二聚體，是一類在細胞與間質、細胞與細胞的相互作用中起關鍵作用的跨膜糖蛋白。細胞外基質-整合素-細胞骨架參與了多種疾病和組織的生理病理變化過程，如腫瘤生長、侵襲、轉移及耐藥等[7]，其中ITGA5作為家族成員中重要的信號傳導通路蛋白，越來越受到關注。

研究表明組織發生惡變后ITGA5表達明顯升高，且化療耐藥后ITGA5亦明顯升高，如結直腸癌[8]、卵巢癌[9]、乳腺癌[10]等。進一步研究中發現，ITGA5在腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡、上皮-間質轉化等過程中發揮了重要作用[11]。如在結腸癌組織中ITGA5與細胞發生上皮細胞-間充質轉化相關，且在低分化結腸癌組織中的表達量亦明顯高于高、中分化組織，同時ITGA5與結腸癌惡性表型及預后差相關[12]。Morozevich等[13]研究發現在耐阿霉素的乳腺癌細胞系中ITGA5異常高表達，促進了乳腺癌的侵襲和轉移。在肝癌順鉑耐藥研究中發現，整合素與肝癌的侵襲和轉移密切相關，整合素過表達能夠抵制順鉑誘導的肝癌細胞凋亡，其作用機制可能是通過活化ERK和p38來發揮抗凋亡作用[14]。整合素β1作為整合素家族一員，在既往卵巢癌鉑類耐藥的研究中也有相關類似的報道，細胞通過其表面的整合素β1與細胞外基質發生黏附后，抑制了順鉑誘導的細胞凋亡，參與了卵巢癌耐藥的發生[15]。因此ITGA5對卵巢癌鉑類耐藥的作用機制有待進一步研究。

在胰腺癌患者中，亦檢測到ITGA5高表達，ITGA5高表達患者，其預后明顯下降，采用siRNA敲除ITGA5可以抑制人胰腺星狀細胞(human pancreatic stellate cell,hPSC)的分化并減少體內的異形增生，針對ITGA5的新型擬肽AV3在3D異球形模型中抑制了hPSC活化并增強了吉西他濱的抗腫瘤作用[16]。ITGA5在卵巢癌的研究較少，有研究發現卵巢癌患者耐藥組中ITGA5的表達明顯高于敏感組，且ITGA5的臨床表達與腫瘤分級、腫瘤大小均是影響卵巢癌預后的獨立危險因素[17]。在非小細胞肺癌中亦發現ITGA5可預測其預后[18]。在乳腺癌[19]、神經膠質瘤[20]等多種腫瘤中亦得到相似結果。本研究在卵巢上皮性癌鉑類耐藥細胞SKOV3/DDP中檢測到ITGA5的高表達，通過siRNA抑制了SKOV3/DDP細胞中ITGA5表達后，SKOV3/DDP細胞侵襲能力明顯下降、細胞的生長速度明顯減慢。與以上多項研究獲得相似的結果，提示ITGA5在卵巢上皮性癌的進展尤其是侵襲、轉移過程中起促進作用。

凋亡被認為是腫瘤細胞程序性死亡，是為更好地適應腫瘤微環境而主動采取的一種死亡過程。研究表明惡性腫瘤的發生、發展，與腫瘤細胞無限增殖及細胞凋亡抑制密切相關，許多化療藥物可通過誘導腫瘤細胞凋亡從而實現對腫瘤細胞的殺傷作用。有研究提示ITGA5參與乳腺癌MCF-Dox細胞的凋亡過程，從而參與了對阿霉素的耐藥過程[13]。本研究亦發現ITGA5在細胞增殖、順鉑敏感性中都發揮的作用，本研究以實驗組細胞的IC50值為基準，設置的三個DDP濃度(1.0 μg/mL、2.0 μg/mL和4.0 μg/mL)分別對三組細胞作用，發現ITGA5基因下調的SKOV3/DDP細胞可一定程度上增加了對DDP的敏感性，同時在ITGA5基因下調后，DDP作用后卵巢癌SKOV3/DDP細胞凋亡率增多，并且隨著DDP劑量增加凋亡率亦升高，存在劑量依賴關系。

綜上所述， ITGA5可能是參與卵巢癌SKOV3/DDP耐藥細胞增殖、侵襲轉移的重要分子，并且在體外水平提示ITGA5參與了卵巢癌SKOV3/DDP凋亡及鉑類耐藥過程，為研究ITGA5作為晚期卵巢上皮性癌的重要標志物及治療靶分子提供了一定的理論基礎，但其具體的分子作用機制還需進一步實驗驗證和闡明。

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