不同分子分型的子宮內膜癌臨床病理特征分析*

孫麗麗，劉格丹，賈楠，馮煒煒

200025上海，上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院 婦產科(孫麗麗、劉格丹、馮煒煒)；200011 上海,復旦大學附屬婦產科醫院 婦科(賈楠)

子宮內膜癌(endometrial cancer，EC)是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，近20年其發病率呈上升且年輕化趨勢。最新流行病學數據顯示，全球范圍內每年有320 000例新發病例及76 000例死亡病例[1]。我國2020年EC新發病例81 964例，死亡病例16 607例，發病率僅次于宮頸癌[2]。傳統的EC分型分為I型和II型：I型為雌激素依賴型，內膜樣腺癌為主要病理類型，II型以p53突變為主要特征，包括漿液性腺癌、透明細胞癌和癌肉瘤等特殊類型。目前臨床上首選的治療方案是手術治療，根據病理類型及分期決定是否補充放化療、化療、激素治療等。早期EC手術治療預后良好，未發生轉移的患者術后5年總生存率有90%，但仍有一些早期低危的患者出現復發，而高危型EC的總體生存率在50%左右，即使術后追加放化療，中位總生存期僅37個月，中位無進展生存期僅13個月[3]。因此迫切需要基于分子特征的個體化精準治療手段。

自從2013年TCGA數據庫把子宮內膜樣腺癌和漿液性癌分為四種分子分型：1)POLE超突變型(POLE ultramutated)、微衛星高度不穩定型(microsatellite instability/hypermutated,MSI-H)、低拷貝變異型/微衛星穩定型(copy number low/microsatellite stable, CNL)、高拷貝型/漿液性樣型(copy number high, CNH/serous-like)后，發現分子分型能更好地預測預后[4]，之后學者們[5]開發了ProMisE分型方法分為：POLE超突變型、MMRd型(mismatch repair protein deficiency)、非特異分子譜NSMP型(no specific molecular profile)，p53異常型(p53abn)，Huvila等[6-8]發現其與TCGA分型高度吻合，但更實用，易于臨床推廣，基于分子特征的新型治療方案如靶向治療、免疫治療、聯合治療給EC患者帶來了新的希望。近期分子分型已應用到少見的病理類型(如癌肉瘤、去分化/未分化癌、透明細胞癌)中，這也有利于對這些高危型腫瘤進行個體化的術后處理和預后判斷。

本研究對在上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院及復旦大學附屬婦產科醫院進行ProMisE分子分型的EC患者進行回顧性分析，探討4種分子分型在EC中的應用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年8月至2022年2月上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院婦產科EC手術患者65例，收集2015年12月至2017年6月復旦大學附屬婦產科醫院EC手術患者21例。總計86例EC患者，其中66例子宮內膜樣腺癌，10例漿液性癌，4例透明細胞癌(2例透明細胞癌，2例透明細胞癌合并子宮內膜樣腺癌)，3例癌肉瘤，3例其他(1例腺體鱗癌、1例去分化癌、1例中腎管腺癌)。所有HE染色病理切片及免疫組化染色切片均由2名有資質的病理科醫師閱片診斷。所有患者均保存完整隨訪及臨床資料。本研究經過上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院及復旦大學附屬婦產科醫院倫理委員會批準，經患者本人知情同意并簽署同意書。

1.2 方法

免疫組織化學染色法，檢測MMR蛋白，包括MLH1(DAKO-IR07961，1∶100)、MSH2(DAKO-IR08561，1∶100)、MSH6(DAKO-IR08661，1∶100)、PMS2(DAKO-IR08761，1∶100)、p53(DAKO-GA61661，1∶200)、ER(DAKO-GA08461，1∶50)、PR(DAKO-IR06861，1∶50)、Ki-67(DAKO-GA62661，1∶200)，PD-L1(DAKO-M366629，1∶100)。其中4種MMR蛋白及p53結果的判讀標準如下：MMR蛋白的陽性表達定位于細胞核，在腫瘤細胞完全陰性時，判讀為MMR蛋白缺失，可表現為一種或多種蛋白同時缺失[9]。p53突變的判讀標準包括：1)均勻一致高表達>80%，常為100%蛋白質不能被降解，堆積所致，呈彌漫性強陽(錯義突變)；2)完全失表達，不能被抗體檢測到(無義突變)；3)胞漿表達，C端的堿基突變，不能進入細胞核；4)腫瘤細胞呈強弱不等的差異性著色判定為野生型[10]。PD-L1： 綜合陽性評分(combined positive score,CPS)的計算方法：每100個腫瘤細胞中PD-L1染色陽性的腫瘤細胞和腫瘤相關的免疫數之和。CPS<1判定為陰性，CPS≥1判定為陽性。

POLE測序方法采用二代測序，應用NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina?(NEB，美國)測序文庫。使用Illumina軟件在cBot Cluster二代測序系統中對樣本進行聚類，并在 Illumina NovaSeq平臺上對文庫制備物進行測序。測序結果應用Chromas2.4.1軟件進行分析，并與標準序列進行比對，確定POLE基因外切酶區域突變的病例。

1.3 ProMisE分子分型流程

EC患者的石蠟標本在明確病理診斷后，第1步：免疫組化檢測4種MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)，發現其中一種或者多種蛋白缺失者歸為MMRd組；如果MMR蛋白無缺失，行第2步：對POLE核酸外切酶第9～14號外顯子區域進行測序，突變者歸為POLE超突變組；對POLE無突變者行第3步：免疫組化檢測p53蛋白表達，p53陽性者或失活者，判讀為p53突變型，歸為p53abn亞型，p53野生型則歸為p53 wt亞型。具體檢測流程圖1如下：

圖1 ProMisE分子分型流程圖

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料經正態性檢驗符合正態分布者以(均數±標準差)表示，不符合正態分布者以中位數表示；T檢驗和單因素方差分析用于計算差異。計數資料以例數和百分率表示。單向無序類數據[病理類型、淋巴結轉移、淋巴脈管間隙浸潤(lymphovascular invasion,LVSI)、ER、PR陽性率及PD-L1等]采用卡方檢驗和Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EC患者臨床病理特征

本研究共納入86例行手術治療EC患者，中位年齡57歲(范圍：32～85歲)。2例行全子宮切除±前哨淋巴結活檢術，1例行全子宮雙附件切除+大網膜、闌尾切除術，16例行全子宮雙附件切除±前哨淋巴結活檢術，18例行全子宮雙附件切除+盆腔淋巴結清掃±大網膜切除，36例行全子宮雙附件切除+盆腔淋巴結清掃+腹主動脈旁淋巴結切除±大網膜切除術，12例行(次)廣泛子宮雙附件切除+盆腔淋巴結清掃±腹主動脈旁淋巴結切除±大網膜、闌尾切除術，1例行全子宮+雙附件切除+直腸腫瘤切除術。86例EC患者按照FIGO分期：I期49例、II期11例、III期18例、IV期8例；其中子宮內膜樣腺癌66例，非子宮內膜樣癌20例(包括漿液性癌10例、透明細胞癌4例、癌肉瘤3例、其他3例，包括1例腺體鱗癌，1例去分化癌，1例中腎管腺癌)。

2.2 EC患者4種ProMisE分子分型在各種傳統病理類型中的占比

86例EC患者中4種分子分型所占比例分別為：POLE突變亞型2.33%(2/86)、MMRd亞型31.40%(27/86)、NSMP亞型40.70%(35/86)、p53abn亞型25.58%(22/86)(圖2)。其中，子宮內膜樣腺癌66例，4種分子分型所占比例分別為：POLE突變亞型3.03%(2/66)、MMRd亞型34.85%(23/66)、NSMP亞型45.45%(30/66)、p53abn亞型16.67%(11/66)。在各分化程度的內膜樣腺癌中4種分子分型的例數(表1)和占比如圖3所示。

圖2 86例EC，ProMisE分子分型占比

表1 86例EC分子分型和臨床病理特征的關系

CharacteristicNPOLE(n=2)MMRd(n=27)NSMP(n=35)p53abn(n=22)χ2PGrade6616.9700.005 G1202 (10.00)4 (20.00)14 (70.00)0 (0) G2250 (0)9 (36.00)11 (44.00)5 (20.00) G3210 (0)10 (47.62)5 (23.81)6 (28.57)ER expression860.6121.000 Positive682 (2.94)21 (30.88)28 (41.18)17 (25.00) Negative180 (0)6 (33.33)7 (38.89)5 (27.78)PR expression863.4980.370 Positive592 (3.39)19 (32.20)26 (44.07)12 (20.34) Negative270 (0)8 (29.63)9 (33.33)10 (37.04)PD-L1 expression5912.7090.003 Positive360 (0)15 (41.67)10 (27.78)11 (30.55) Negative231 (4.35)3 (13.04)16 (69.56)3 (13.05)

漿液性癌10例中NSMP亞型占20%(2/10)、p53abn亞型占80%(8/10)。癌肉瘤3例中NSMP亞型占33.33%(1/3)，p53abn亞型占66.67%(2/3)。透明細胞癌4例中3例為MMRd亞型占75%，1例(25%)為p53abn亞型。其他類型3例，分子分型所占比例分別為：MMRd亞型33.33%(1例腺鱗癌)、NSMP亞型66.67%(1例去分化癌和1例中腎樣癌均為NSMP型)(圖3)。

圖3 86例EC不同病理類型ProMisE分子分型占比

2.3 EC患者4種ProMisE分子分型的組織學特征的差異

如表1所示：4種分子分型患者的年齡、肌層浸潤深度、淋巴結轉移、ER、PR陽性比等差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。POLE、MMRd、NSMP亞型更傾向于臨床早期(在FIGOI～II期中占比更高)和子宮內膜樣癌類型，而p53abn型患者診斷時更多為III～IV期和非內膜樣癌(P值分別為0.034和0.011)。而在子宮內膜樣癌中，POLE和NSMP亞型主要為高中分化[POLE：(G1期100%，NSMP：(G1+G2)占83.33%(25/30)]；MMRd和p53abn亞型多為中低分化[MMRd：(G2+G3)占82.61%(19/23)，p53abn：(G2+G3)占100%]。

2.4 4種分子亞型與Ki-67、PD-L1表達的關系

四種分子亞型的Ki-67陽性率分別如下,POLE突變亞型:42.50%±27.50%；MMRd亞型：51.22%±4.81%；NSMP亞型：46.57%±3.35%；p53abn亞型：60.91%±4.42%，4組之間差異無統計學意義(χ2=1.748,P=0.649)。

一共59例患者做了PD-L1檢測，1例POLE PD-L1陰性；18例MMRd型中：3例CPS<1，7例CPS：1～10；8例CPS>10，PD-L1陽性率(CPS≥1)為83.33%；26例NSMP亞型中：16例CPS<1，9例CPS：1～10,1例CPS>10，PD-L1陽性率為38.46%；14例p53abn型中：3例CPS<1，10例CPS：1～10，1例CPS>10,PD-L1陽性率為78.57%。MMRd亞型中PD-L1陽性率最高，且CPS>10的比例達到44.44%。其次為p53abn亞型，但此亞型中90.91%的PD-L1陽性者的CPS值僅為1～10。而NSMP型PD-L1陽性率低。

2.5 MMRd亞型中4種MMR蛋白的表達情況

27例患者中，4種MMR蛋白可單獨或聯合表達缺失。MLH1蛋白表達缺失率最高占55.56%(15/27)，且大多數聯合PMS2表達缺失。具體為1/27例(3.70%)單純MLH1表達缺失；13/27例(48.15%)表現為MLH1/PMS2聯合表達缺失；1/27例(3.70%)表現為MLH1/MSH2聯合表達缺失。其次為MSH2蛋白表達缺失(9/27,33.33%)，且多與MSH6聯合表達缺失：8/27例(29.63%)表現為MSH2/MSH6聯合表達缺失；1/27例(3.70%)表現為MSH2/PMS2聯合表達缺失。另有1例(3.70%)表現為單純MSH6表達缺失；2/27例(7.41%)表現為PMS2表達缺失。

3 討 論

近年來EC分子分型逐漸在臨床應用，為預后判斷和治療方案選擇提供參考。我們的研究提示了子宮內膜樣腺癌中POLE突變亞型占3.03%、MMRd亞型占34.85%、NSMP亞型占45.45%、p53abn亞型占16.67%。漿液性癌和癌肉瘤中主要是p53abn型,其次為NSMP型。透明細胞癌中MMRd型占75%，其次是p53abn型。從病理特征來看：POLE、MMRd、NSMP亞型更傾向于臨床早期(FIGO I～II期)和子宮內膜樣癌類型，而p53abn型患者診斷時更多為III～IV期和非內膜樣癌。而在子宮內膜樣癌中，POLE和NSMP亞型主要為高中分化，MMRd在和p53abn亞型多為中低分化。4種分子分型的PD-L1陽性率也有明顯差異，MMRd型最高83.33%，p53abn型為78.57%，NSMP為38.46%。

我院子宮內膜樣癌中4種分子分型的比例與第5版WHO中給出的對應比例12%、30%、40%及18%，二者在構成比上基本一致，在POLE超突變亞型中略有差距，可能與本研究的樣本量較少有關。文獻報道[11-12]POLE超突變亞型的典型特征包括：發生在相對年輕患者、FIGO分期早、腫瘤級別高；MMRd亞型與POLE超突變亞型相似；NSMP亞型常表現為G1、G2子宮內膜樣癌；p53abn亞型包括漿液性癌及絕大多數G3子宮內膜樣腺癌。本研究病例中多數特征基本與文獻報道符合。也有文獻報道p53abn亞型除上述特征外，經常表現為與LVSI、肌層浸潤深度相關，本研究未發現其相關性，還需未來收集更多病例進行驗證。

在一些少見的病理類型進行分子分型對于了解疾病的本質有更大的意義。Travaglino等[13]薈萃分析4項研究共231例子宮癌肉瘤患者，將其按TCGA分子分型進行亞組分析，發現CNH亞型在癌肉瘤中占主導地位(73.9%)。同年該研究小組[14]對73例未分化/去分化EC進行TCGA分子分型，發現MSI型占優勢，為44%，POLE超突變型占12.4%，p53突變型為18.6%，p53野生型為25%。這表明其與其他高危組織學類型的EC存在關鍵差異。子宮內膜透明細胞癌是分子特點最不明確的組織類型，該研究小組[15]薈萃分析了5項研究中共162例子宮內膜透明細胞癌患者的TCGA分子分型，發現CNH型(42.5%)和CNL型(40.9%)最常見，而MSI型(9.8%)和POLE超突變型(3.8%)占比小。在本次研究中4例透明細胞癌3例為MMRd型，1例去分化癌為NSMP型，1例中腎樣癌為NSMP型，這有助于對患者預后的判斷，同時也提示某些高危型患者可能受益于免疫治療。

免疫治療在復發或轉移性EC中已經成為推薦方案。在Keynote158研究中發現PD-1抗體(帕博麗珠單抗)治療PD-L1陽性的轉移性EC有效[16]。通過對不同分子分型的內膜癌進行PD-L1檢測，可以更好地指導治療。2021年Victoor等[17]對120例EC病例在ProMisE的基礎上，聯合進行全面的免疫分子分析，對CD3、CD8、PD-L1、β-連環蛋白和L1CAM進行免疫組織化學染色，發現POLE-mut型和MMRd型通常表現出更高數量的CD3+/CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)和更高的PD-L1表達。另有Talhouk等[18]在ProMisE的基礎上，增加TILs和免疫抑制因子(CD3、CD8、CD79a、CD138等)的檢測，發現高TILs腫瘤常見于MMRd型和POLE超突變型。在我們的研究中，MMRd型PD-L1陽性率最高83.33%，與文獻報道相似，而p53abn型也有PD-L1陽性率達78.57%，提示部分高危型EC也可能獲益于免疫治療。而NSMP型由于缺乏特異的分子特征譜，治療目前仍然以標準治療為主，我們發現NSMP型PD-L1陽性率為38.46%，也為部分患者提供了一個治療選擇。除外PD-L1等免疫分子檢測，TILs和免疫抑制因子也將成為后續研究熱點，為分子分型亞分類提供理論依據。

綜上所述：目前，EC的術后病理報告中不但包括分子分型，仍需要組織學分類、FIGO分級等內容，并增加免疫特征分子的檢測。分子分型在臨床應用中具有更客觀、重復性強等特征，與傳統的病理相結合，未來可用于探索添加輔助治療的有效手段，為EC患者個體化診斷及治療提供新策略。

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