蒲公英甾醇治療大鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制初步探索

謝子康，史銘鈺，蔣陽，王斌，沈鵬飛，鄭沖，楊曉峰

(常州市中醫(yī)醫(yī)院骨一科，江蘇 常州 213000)

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)周圍組織慢性、退行性改變的疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展過程中，炎性因子亦扮演著重要角色，即炎性介質(zhì)的過度表達(dá)伴隨著組織的逐漸退化[1]。蒲公英是菊科植物蒲公英的干燥全草，現(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英還具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種作用[2]；蒲公英甾醇是蒲公英的主要有效成分之一；動物及細(xì)胞試驗(yàn)顯示，蒲公英甾醇可抑制白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的炎癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，其作用機(jī)制可能包括抑制炎性因子水平、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路等[3-4]；因此，蒲公英甾醇的抗炎、抗氧化作用亦有望應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的治療中。然而，目前國內(nèi)外研究尚無針對蒲公英甾醇治療KOA的探討，為彌補(bǔ)這一空白，此次研究擬通過動物試驗(yàn)對蒲公英甾醇治療KOA大鼠的作用機(jī)制進(jìn)行初步了解，從而為后續(xù)研究提供參考依據(jù)，也為KOA的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康4周齡SD雄性大鼠50只，每只大鼠重量240～260 g。由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物合格證號SCXK(蘇)2019-0004。

1.2 試藥與儀器 蒲公英甾醇由成都瑞芬思生物科技有限公司提供(CAS：1059-14-9)；木瓜蛋白酶、半胱氨酸由江蘇佰耀生物科技有限公司提供；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒由北京博奧派克生物科技有限公司提供；全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)由晶檀生物科技(上海)有限公司提供；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)儀由美國 Bio-rad iCycler iQ 伯樂公司提供，各種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)抗體、試劑盒、引物均由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司提供；酶標(biāo)儀由上海賽默科技生物發(fā)展有限公司提供；-80℃超低溫冰箱MDF-C8V由SANYO三洋電機(jī)提供；光學(xué)顯微鏡由日本奧林巴斯提供；臺式高速冷凍離心機(jī)H2050R由湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司提供。

1.3 KOA大鼠模型的建立及分組給藥方式 參照文獻(xiàn)[5]方案建立KOA大鼠模型：大鼠稱重后置于實(shí)驗(yàn)操作臺上，按3 mL/kg劑量給予腹腔注射水合氯醛麻醉，無菌條件下行大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔穿刺，自髕骨外下方進(jìn)針，確定進(jìn)入關(guān)節(jié)腔后向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 mL濃度預(yù)制好的4%木瓜蛋白酶溶液+0.03 mmol/L半胱氨酸混合液，隔日注射1次，持續(xù)2周。每日定時驅(qū)趕強(qiáng)迫大鼠活動30 min，增加其活動量以促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎模型建立；每日觀察大鼠肢體活動情況及關(guān)節(jié)有無感染、腫脹等。假手術(shù)組造模術(shù)中左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔穿刺后注射生理鹽水0.2 mL，其余操作與前述相同。研究組建模成功后，分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、假手術(shù)組，各10只；每日上午9～10時分別給予蒲公英甾醇2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg及生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)4周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血清生化指標(biāo)的檢測 抽取各組大鼠心尖處血液樣本，2 000 r/min的條件下離心15 min，獲取血清；采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine aspartic acid protease，Capase-1)水平。

1.4.2 RT-qPCR法測定關(guān)節(jié)軟骨組織中微小RNA(microRNA，miRNA)-140、miRNA-146a表達(dá)水平 用頸椎脫位法處死全部大鼠，打開每只大鼠左膝關(guān)節(jié)腔，取左膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用Trizol試劑提取總RNA，用Prime Script RT試劑盒將每個樣本的2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃條件下15 min，5℃條件下5 s，4℃條件下30 min。以β-actin為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.4.3 Western blot法測定關(guān)節(jié)軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 采用 Western blot法測定關(guān)節(jié)軟骨組織中核因子κB抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)、IκB激酶β(inhibitor κB kinase β，IKKβ)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)、NOD樣受體家族3(NOD-like receptors 3，NLRP3)、凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)的表達(dá)水平。取各組大鼠左膝關(guān)節(jié)軟骨組織，加入緩沖液提取蛋白，濕式電泳儀轉(zhuǎn)膜300 mA、60 min；5%脫脂牛奶室溫下封閉 1 h；Ⅰ抗和內(nèi)參照抗體 4 ℃孵育16 h；加入稀釋好的二抗(抗兔 IgG)，在室溫下孵育1 h，使用電化學(xué)發(fā)光顯影，并使用ChemiDoc XRS(BioRad)顯色，lphaEase FC軟件取值，分析目標(biāo)帶與內(nèi)參帶的灰度值比值。

1.4.4 關(guān)節(jié)軟骨組織的病理觀察 制備各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織石蠟切片，充分剝離皮膚肌肉之后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，10%稀鹽酸脫鈣2～4 d，梯度脫水后石蠟包埋，行額狀面切片(沿膝關(guān)節(jié)矢狀面將脛骨內(nèi)側(cè)平臺軟骨下松質(zhì)骨和股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨下松質(zhì)骨沿下肢縱軸方向切片，厚度約5 mm)、HE染色，常規(guī)脫水、透明、封片處理。參照Mankin法行軟骨組織評分，包括結(jié)構(gòu)(0～6分)、細(xì)胞(0～3分)、基質(zhì)染色(0～4分)、潮線完整性(0～1分)4個部分；總評分為各部分評分之和(0～14分)，評分越高表示關(guān)節(jié)軟骨組織性質(zhì)越差。

2 結(jié) 果

2.1 5組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、Capase-1水平的比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、Capase-1水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，高劑量組、中劑量組及低劑量組的血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、Capase-1水平均明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組均明顯低于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，中劑量組均明顯低于低劑量組(P<0.05，見表2)。

表2 5組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、Capase-1水平的比較

2.2 5組關(guān)節(jié)軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達(dá)水平的比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的關(guān)節(jié)軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達(dá)水平均明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，高劑量組、中劑量組及低劑量組的關(guān)節(jié)軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達(dá)水平均明顯高于模型組(P<0.05)，高劑量組均明顯高于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，中劑量組均明顯高于低劑量組(P<0.05，見表3)。

2.3 5組關(guān)節(jié)軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平的比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的關(guān)節(jié)軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，高劑量組、中劑量組及低劑量組的關(guān)節(jié)軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組均明顯低于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，中劑量組均明顯低于低劑量組(P<0.05，見表4、圖1)。

表3 5組關(guān)節(jié)軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達(dá)水平的比較

表4 5組關(guān)節(jié)軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平的比較

圖1 5組關(guān)節(jié)軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達(dá)的Western blot法檢測圖

a 假手術(shù)組 b 模型組

c 低劑量組 d 中劑量組

e 高劑量組

2.4 5組關(guān)節(jié)軟骨組織病理情況的比較 KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理情況：假手術(shù)組關(guān)節(jié)軟骨表面平整光滑，無裂縫或缺損，軟骨細(xì)胞形態(tài)正常、排列整齊，潮線完整，軟骨基質(zhì)染色均勻；模型組關(guān)節(jié)軟骨表面不平整，有缺損及裂縫，節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)異常、排列紊亂，潮線缺損，軟骨基質(zhì)染色不均勻；低劑量組：關(guān)節(jié)軟骨表面比較光滑，軟骨細(xì)胞形態(tài)異常，排列紊亂，潮線缺損，軟骨基質(zhì)染色不均勻；中劑量組與高劑量組關(guān)節(jié)軟骨表面平整，軟骨細(xì)胞排列較為整齊，潮線基本完整，關(guān)節(jié)軟骨染色均勻(見圖2)。

高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin評分均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，高劑量組、中劑量組及低劑量組的關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin評分均明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組均明顯低于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，中劑量組均明顯低于低劑量組(P<0.05，見表5)。

表5 5組關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin評分的比較分)

3 討 論

3.1 蒲公英甾醇對KOA大鼠炎性細(xì)胞因子的影響 KOA的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，KOA的關(guān)節(jié)軟骨及周圍骨質(zhì)會發(fā)生病理性改變，在關(guān)節(jié)軟骨的破壞過程中會產(chǎn)生大量的基質(zhì)降解產(chǎn)物及炎癥介質(zhì)，炎癥(特別是滑膜炎癥)在KOA的發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要角色[6]。TNF-α與IL-6能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白發(fā)生降解，加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞；IL-6基因敲除可導(dǎo)致小鼠發(fā)生KOA，提示IL-6是KOA關(guān)節(jié)軟骨破壞的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)[7]。MMP是一類結(jié)構(gòu)相似的蛋白酶，可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生降解，引起膠原纖維變薄，加速膠原成分的裂解，膠原排列出現(xiàn)松散，造成軟骨基質(zhì)發(fā)生腫脹，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生變性，從而導(dǎo)致KOA[8]。IL-1β是一種強(qiáng)效促炎細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞合成MMP，在KOA關(guān)節(jié)軟骨的退變過程中發(fā)揮著重要作用[9]。Caspase-1是IL-1β的轉(zhuǎn)化酶，能對IL-1β前體進(jìn)行加工，成為IL-1β活性形式，是對IL-1β進(jìn)行激活的重要環(huán)節(jié)，Caspase-1在KOA動物模型關(guān)節(jié)軟骨組織中高表達(dá)[10]。本研究中，與假手術(shù)組比較，藥物組與模型組的以上各項(xiàng)炎性因子水平均明顯增高，進(jìn)一步說明了KOA的發(fā)生及發(fā)展與炎性因子存在密切關(guān)系；而與模型組比較，KOA大鼠蒲公英甾醇灌胃4周后以上各項(xiàng)炎性因子水平均明顯降低，隨著給藥劑量的增加而明顯降低，提示蒲公英甾醇能夠降低KOA大鼠的血清炎性因子水平，且呈劑量依賴性。

3.2 蒲公英甾醇對KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達(dá)水平的影響 KOA的發(fā)生及發(fā)展受到表觀遺傳調(diào)控的影響，miRNA是KOA基因調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。有研究[11]顯示，9種miRNA在KOA關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達(dá)水平上調(diào)，7種miRNA的表達(dá)水平下調(diào)。miRNA-140、miRNA-146a主要在軟骨組織中表達(dá)，在關(guān)節(jié)軟骨的生長發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持及損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用[12]。在大鼠胚胎骨發(fā)育過程中，miRNA-140在軟骨組織中的表達(dá)水平特異性增高；miRNA-140對蛋白聚糖酶-5的表達(dá)具有調(diào)控作用，對大鼠miRNA-140基因進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)，增齡性KOA關(guān)節(jié)軟骨退變的發(fā)生率增高，而關(guān)節(jié)軟骨組織中miR-140的高表達(dá)對手術(shù)誘發(fā)的KOA具有對抗作用[13-14]。以往研究[15]顯示，miRNA-146a能對蛋白聚糖酶及MMP在軟骨組織中的表達(dá)進(jìn)行抑制，可能與NF-κB等信號通路活化受阻有關(guān)；miRNA-146a能對MMP-13及胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-5的合成進(jìn)行間接調(diào)控，參與膝關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。臨床研究[16-17]顯示，相對于非KOA患者，KOA患者關(guān)節(jié)滑液中miRNA-140、miRNA-146a的表達(dá)水平明顯降低。本研究中，與假手術(shù)組比較，藥物組與模型組的miRNA-140、miRNA-146a表達(dá)水平均明顯降低，提示當(dāng)miRNA-140、miRNA-146a高表達(dá)時，KOA關(guān)節(jié)軟骨退變得到抑制，即miRNA-140、miRNA-146a是KOA的保護(hù)因素；蒲公英甾醇治療4周后miRNA-140、miRNA-146a的表達(dá)水平明顯高于模型組，隨著給藥劑量增加而明顯增高，分析原因可能是蒲公英甾醇治療后TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子水平降低，滑膜細(xì)胞凋亡減少，miRNA-140、miRNA-146a的降解減少。

3.3 蒲公英甾醇對KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平的影響 KOA的發(fā)生及發(fā)展中存在炎性細(xì)胞因子、蛋白與信號通路的相互調(diào)控，能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的合成-分解代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變[18]。NF-κB蛋白家族可以選擇性的結(jié)合在B細(xì)胞κ-輕鏈增強(qiáng)子上調(diào)控許多基因的表達(dá)；動物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[19-20]均表明，NF-κB信號通路在KOA中被過度激活；NF-κB對Ⅱ型膠原的表達(dá)起到抑制作用，對TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的表達(dá)起到促進(jìn)作用，從而促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生；NF-κB還能對NO的產(chǎn)生起到調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡，而對NF-κB信號通路的病理性激活進(jìn)行抑制，能促進(jìn)KOA關(guān)節(jié)軟骨病變的修復(fù)。IκB是NF-κB的抑制蛋白，IKKβ是IκB激酶的一種亞單位，IκB與IKKβ在NF-κB信號通路的激活過程中起到支柱性作用；NF-κB信號通路通過促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)或細(xì)胞膜受體級聯(lián)激活，導(dǎo)致NF-kB誘導(dǎo)激酶(NF-kB-inducing kinase，NIK)激活，進(jìn)而活化IKKβ，磷酸化IκB，最終導(dǎo)致KOA軟骨組織降解及發(fā)生關(guān)節(jié)損傷[21]。TAK1是促分裂原活化蛋白-3kinase(mitogen-activated protein-3 kinase，MAP3K)家族的成員之一，是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路與NF-κB信號通路上游的重要激酶，能被多種促炎性細(xì)胞因子激活[22]；臨床研究[23]顯示，骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中的TAK1的表達(dá)水平明顯上調(diào)，對TAK1基因及蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，能降低下游炎性因子及MMP等相關(guān)蛋白酶的表達(dá)。NLRP3炎性小體含有ASC、Caspase蛋白酶，能調(diào)節(jié)Caspase-1的活化，促進(jìn)前體pro-IL-1β、pro-TNF-α等炎性細(xì)胞因子的成熟和分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)[24]；以往研究[25]顯示，NLRP3在兔KOA模型軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著增高；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α可以促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞中NLRP3的蛋白表達(dá)[26]；臨床研究[27]顯示類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中NLRP3、ASC mRNA相對表達(dá)量顯著升高。本研究中，與假手術(shù)組比較，藥物組與模型組的IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平均明顯增高，提示TAK1/NF-κB、NLRP3信號通路過度激活是KOA的發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制之一；蒲公英甾醇治療4周后的以上指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，隨著給藥劑量的增加而明顯降低，提示對TAK1/NF-Κb、NLRP3信號通路病理性激活進(jìn)行抑制是蒲公英甾醇治療KOA大鼠的作用機(jī)制，且呈劑量依賴性。同時本研究還觀察到蒲公英甾醇能明顯減輕KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織的Mankin評分，隨著給藥劑量的增加，效果明顯增加，原因是蒲公英甾醇抑制了KOA大鼠的炎性反應(yīng)。

3.4 小結(jié) 蒲公英甾醇對大鼠KOA具有保護(hù)作用，能減輕關(guān)節(jié)軟骨組織的病理學(xué)改變，且呈劑量依賴性，炎癥抑制、miRNA表達(dá)上調(diào)及TAK1/NF-κB、NLRP3信號通路活化受阻可能是其作用機(jī)制。下一步將對炎性細(xì)胞因子、miRNA及相關(guān)信號通路之間的關(guān)系，TAK1/NF-κB、NLRP3信號通路上下游的傳導(dǎo)機(jī)制等進(jìn)行深入研究，為蒲公英甾醇治療KOA的新藥開發(fā)及臨床治療提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。