涼粉草精油微乳液抗氧化和抗A375細胞增殖活性

羅偉斌，曹揚建，吳爾文，趙振剛

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

涼粉草（Mesona chinensisBenth.）又名仙草、仙人草，為唇形科涼粉草屬一年或多年生草本植物，廣泛分布于東南亞和我國江西、廣東、福建、廣西、云南等地[1-2]。我國涼粉草資源豐富、價格低廉，有廣闊的產品開發利用前景[2]，涼粉草在日常飲食中被用作黑涼粉的原料，也被用于生產制作涼茶、龜苓膏等食品，涼粉草資源的生產加工附加值較低。涼粉草精油（Mesona chinensisBenth. essential oil，M.EO）作為涼粉草中具有活性的組分之一，其受到的關注較少，現有的一些研究報道集中在其組分的種類及含量分析[3-5]，鮮有關于抗菌活性的報道[6-7]。植物精油為高附加值的產品，因此研究M.EO的生物活性將為涼粉草資源的高值化開發與利用提供新的思路和理論依據。

植物精油是天然的植物次級代謝產物，其除了具有芳香氣味外，還具有抗氧化、抗增殖、抗炎、抗菌、抗病毒等活性，因此在食品、日化、醫療保健等領域廣受關注[8-9]。但是，植物精油的水溶性差、易揮發，且對溫度、光照等條件敏感，在實際應用中受到極大限制。

微乳液是由一定比例的油相、水相、表面活性劑、助表面活性劑所形成的各向同性、熱力學穩定體系[10]。微乳液可根據所要包埋的活性物特性來設計其組分和結構，能夠極大地拓展植物精油的應用。此外，因其具有粒徑小、可自發形成、制備簡單、組分易得等優點，被廣泛用于食品、醫藥、日化等行業[11]。

本實驗通過水蒸氣蒸餾法提取M.EO，并通過氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀分析其組成；選擇在食品行業廣泛應用的材料分別作為表面活性劑和助表面活性劑，在涼粉草精油微乳液（M.EO microemulsion，M.EO-ME）構建前使用偽三元相圖來篩選合適的助表面活性劑、表面活性劑、表面活性劑與助表面活性劑質量比（Km）和混合表面活性劑與油相的質量比（Smix）；通過黏度、電導率、亞甲基藍擴散情況、粒徑、多分散指數（polydispersity index，PDI）來表征微乳液的構型變化和理化性質；最后采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）、過氧自由基清除能力（peroxyl radical scavenging capacity，PSC）法以及人惡性黑色素瘤細胞A375細胞模型來比較M.EO和M.EO-ME的抗氧化、抗腫瘤細胞增殖活性，以期為涼粉草資源的高值化開發與利用提供理論依據，為涼粉草精油的商業化應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

涼粉草（干制品）購于武平盛達農業發展有限責任公司。

甘油、1,2-丙二醇、無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、正己烷上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸（VC）、DPPH、水溶性維生素E（Trolox）、2,7-二氯二氫熒光素二乙酯（dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸（2,2’-azobis(2-amidinopropane)-dihydrochloride，ABAP）、熒光素鈉 美國Sigma公司；人惡性黑色素瘤細胞A375細胞 美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（75 mmol/L、pH 7.4）、高糖培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM） 美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液 上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清 浙江天航生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

水蒸氣蒸餾裝置 佛山捷特輕工機械有限公司；7890A-5975C型GC-MS、DB-5ms氣相色譜毛細管柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；DDS-11A電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；NDJ-8S旋轉黏度計 上海昌吉地質儀器有限公司；Zetasizer Nano ZSE納米粒度儀 英國Malvern公司；DU730分光光度計 美國Beckman Coulter公司；Filter Max F5多功能酶標儀 美國Molecular公司；細胞CO2培養箱美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 涼粉草精油的提取

M.EO采用水蒸氣蒸餾法提取[12]：將涼粉草粗粉碎至長度約3 cm，取120 kg粉碎后的涼粉草于水蒸氣蒸餾裝置中，按照料液比1∶10（m/V）加入1 200 kg水，保持微沸狀態蒸餾3 h。收集冷凝液上層精油粗提物（約20 L），分多次萃取粗提物，每次取1 L的粗提物用1.5 L的石油醚萃取，重復萃取2 次。收集萃取所得上層液體（有機相），加入無水硫酸鈉干燥30 min，過濾后將濾液45 ℃旋轉蒸發去除石油醚，得澄清透明的金黃色M.EO，密封于棕色玻璃瓶中，4 ℃避光保存備用。

1.3.2 氣相色譜-質譜聯用分析涼粉草精油的組分

GC-MS分析前，M.EO需用正己烷按照體積比1∶100稀釋。

氣相色譜條件：色譜柱：DB-5ms氣相色譜毛細管柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（99.999%）；進樣口溫度：250 ℃；柱流速：1 mL/min；進樣量0.2 μL；分流比30∶1；升溫程序：60 ℃保持3 min；3 ℃/min升溫至120 ℃；4 ℃/min升溫至180 ℃；15 ℃/min升溫至280 ℃，保持15 min。

質譜條件：接口溫度：280 ℃；電子轟擊離子源，電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質量掃描范圍：33～450m/z；檢索譜庫：Nist08，最后用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.3.3 M.EO-ME的制備及偽三元相圖的繪制

首先將表面活性劑與助表面活性劑混合形成混合表面活性劑，兩者的質量比為Km。以M.EO為油相，制備混合表面活性劑與M.EO質量比（Smix）分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的混合油相，然后一邊攪拌一邊在混合油相中逐滴滴加去離子水，記錄體系達到臨界點（由澄清變渾濁）時加入去離子水的體積，根據已加入的混合表面活性劑和油相的質量繪制偽三元相圖，分別以混合表面活性劑、油相、水相作為偽三元相圖的3 個頂點，根據油相、水相、混合表面活性劑在臨界點的質量分數來確定該點在相圖中的位置，記錄臨界點在偽三元相圖上的位置，由臨界點圍成的區域為微乳區域，通過Originlab繪圖軟件計算微乳區域相對面積。

1.3.4 M.EO-ME的組成優化和影響因素

1.3.4.1 助表面活性劑的種類對微乳液形成的影響

以吐溫80為表面活性劑，分別與無水乙醇、甘油、1,2-丙二醇以Km＝2∶1進行混合，得到混合表面活性劑，并參照1.3.3節的方法繪制偽三元相圖，比較各助表面活性劑的微乳區域相對面積。

1.3.4.2 表面活性劑的種類對微乳液形成的影響

以無水乙醇為助表面活性劑，分別與吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80以Km＝2∶1進行混合，得到混合表面活性劑，并參照1.3.3節的方法繪制偽三元相圖，比較各表面活性劑的微乳區域相對面積。

1.3.4.3Km對微乳液形成的影響

以吐溫60為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，兩者以Km分別為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1進行混合，得到混合表面活性劑，并參照1.3.3節的方法繪制偽三元相圖，比較各Km的微乳區域相對面積。

1.3.5 M.EO-ME的構型分析

黏度和電導率的變化可以簡單且直觀地反映微乳液的不同構型間的轉變，因此被廣泛應用于微乳體系的構型表征[13]。此外，通過觀察親水性或親油性的染液在微乳體系中的擴散情況，同樣可以直觀地表征微乳液的構型轉變[14]。制備水分質量分數分別為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，以吐溫60為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，Km＝2∶1和Smix＝8∶2的微乳液。在25 ℃下，測定各體系的電導率和黏度，并在各體系中滴加2 滴水溶性染液亞甲基藍（1 g/L），觀察染液擴散情況，分析微乳液的構型變化。

1.3.6 M.EO-ME的理化性質和稀釋穩定性分析

參照1.3.5節方法測定M.EO-ME（Km＝2∶1、Smix＝8∶2、水分質量分數＝70%）的電導率和黏度，然后在25 ℃條件下，用100、200 倍體積的去離子水將M.EO-ME稀釋，使用Zetasizer Nano ZSE納米粒度儀測定其平均粒徑和PDI。

1.3.7 M.EO及其微乳液的抗氧化活性測定

參考文獻[15]測定M.EO及其微乳液的DPPH自由基清除能力。稱取一定量的DPPH粉末溶解于無水乙醇中配制成2 mmol/L的DPPH儲備液。DPPH儲備溶液在使用前用無水乙醇稀釋得到0.2 mmol/L DPPH工作液。取1 mL 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/mL M.EO及微乳液樣品（均以精油計）或5、15、20、25 μg/mL VC溶液，與等體積的DPPH工作液混合均勻。于25 ℃避光反應30 min后，在517 nm波長處測定溶液的吸光度。DPPH自由基清除率按照公式（1）計算。以VC為陽性對照，采用Calcusyn軟件分別計算VC、M.EO和M.EO-ME的半數效應劑量（median effective concentration，EC50），以VC EC50與樣品EC50的比為樣品的DPPH值/（μmol/g）。

式中：樣品與DPPH工作液的混合液吸光度為As；無水乙醇與樣品的混合液吸光度為A0；無水乙醇與DPPH工作液的混合液吸光度為空白對照Ac。

參考文獻[16]測定M.EO及其微乳液的ORAC。分別稱取Trolox和樣品，用PBS配制6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L的Trolox溶液以及不同質量濃度的樣品。在避光的環境下，分別在黑色96?孔板中加入20 μL/孔不同劑量的Trolox溶液或樣品，并加入200 μL 0.96 μmol/L熒光素鈉鹽，混合均勻。在37 ℃下孵育20 min后，每孔加入20 μL 119 mmol/L ABAP溶液。將黑色96?孔板放入多功能酶標儀中，設置激發波長和發射波長分別為485 nm和538 nm。在37 ℃下，每5 min測定一次熒光強度，共35?個熒光循環。以Trolox為陽性對照，ORAC由回歸方程計算得到，并以Trolox當量表示，單位為μmol/mg。

參考文獻[17]測定M.EO及其微乳液的PSC。用PBS稀釋得到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL的M.EO和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的M.EO-ME（以精油計）或1.0、2.4、3.2、4.8、6.3 μg/mL的VC溶液。黑色96?孔板中分別加入100 μL不同質量濃度的樣品或VC溶液。預先加入1 mmol/L KOH溶液使DCFH-DA水解5 min，然后向黑色96?孔板的每孔加入100 μL 13.26 μmol/L DCFH-DA和50 μL 200 mmol/L ABAP。將黑色96?孔板放入多功能酶標儀中，設置激發波長和發射波長分別為485 nm和538 nm。在37 ℃下，每5 min測定一次熒光強度，共40 min。以VC為陽性對照，PSC以VC當量表示，單位為μmol/g。

1.3.8 M.EO及其微乳液的細胞毒性和抗增殖活性測定

人惡性黑色素瘤細胞A375的培養基為含有10%（體積分數）的胎牛血清、10 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和1%（體積分數）青霉素-鏈霉素溶液的高糖DMEM培養基。細胞在37 ℃、5%（體積分數）CO2細胞培養箱中培養。

參考文獻[18]，采用亞甲基藍測定法評價M.EO及其微乳液的細胞毒性。先用培養基分別稀釋得到60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 μg/mL M.EO或10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL M.EO-ME（以精油質量計）。按2.5h104個/孔將細胞接種在96?孔板上。在細胞培養箱中孵育24 h后，吸棄培養液，每孔加入100 μL不同質量濃度的樣品，設3 個復孔，以加入100 μL不含樣品的培養基為對照組，加入100 μL PBS作為空白組，繼續孵育24 h，吸棄培養液，每孔用100 μL PBS洗滌細胞，加入50 μL亞甲藍溶液（6 g/L）對細胞進行染色。于培養箱中孵育1 h后，吸棄亞甲藍溶液，96?孔板用清水洗凈，拍干并向每孔加入100 μL乙醇-PBS-乙酸洗脫液（體積比為50∶48∶1），振蕩20 min。將96?孔板放入全波長酶標儀，測定570 nm波長處的吸光度。按照公式（2）計算細胞毒性。

式中：As為樣品孔減去空白孔的吸光度；Ac為對照孔減去空白孔的吸光度。

參考文獻[19]進行抗增殖活性評價。按1.5h104個/孔將細胞接種在96?孔板上，并在恒溫培養箱中孵育4 h。移除培養基后，每孔分別加入100 μL質量濃度60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 μg/mL M.EO或質量濃度10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL M.EO-ME（以精油質量計）。以加入100 μL不含樣品的培養基作為對照組，加入100 μL PBS作為空白組。孵育48 h后，用前述細胞毒性的方法染色、讀板。細胞增殖率按照公式（3）計算。

式中：As為樣品孔減去空白孔的吸光度；Ac為對照孔減去空白孔的吸光度。

1.4 數據處理與分析

所有樣品均設置3?個平行，處理后的數據以平均值±標準差表示。采用Origin 2020軟件作圖，Sigmaplot 14.0軟件計算曲線下積分面積，采用Calcusyn 2.1軟件計算濃度效應，采用SPSS 22.0統計分析軟件進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 M.EO的化學組分

從M.EO分離出42種組分，根據峰面積歸一化法計算各組分相對含量，其中相對含量高于1%的組分有17種，占總峰面積的91.58%。由表1可知，M.EO中相對含量較高的組分有香樹烯（25.53%）、β-石竹烯（19.31%）、異石竹烯（11.30%）、甲位葎草烯（8.30%）、佛術烯（7.62%），這些組分主要為烯萜類化合物及其氧化物。

表1 M.EO揮發性組分中相對含量高于1%的組分Table 1 Volatile components of M.EO with relative content greater than 1%

有文獻報道，M.EO中的主要組分如香樹烯、β-石竹烯、異石竹烯和甲位葎草烯等具有較好的抗氧化、抗增殖活性[20-22]，因此可為其后續的活性研究奠定基礎。

2.2 M.EO-ME的構建和優化

2.2.1 助表面活性劑對微乳液形成的影響

在微乳液形成過程中，助表面活性劑能夠嵌入到水-油界面中，促進表面活性劑在體系中的分散，從而降低表面張力，提高水-油界面膜的流動性和彈性，同時，它可以溶解在水相和油相中，起到調節兩相極性的作用[23]。從圖1可知，3種助表面活性劑形成的微乳區域相對面積由大到小依次為無水乙醇＞1,2-丙二醇＞甘油，隨著助表面活性劑羥基數量的增加，微乳區域相對面積減小。這可能是由于醇類分子體積的增加不利于水-油界面膜的彎曲，引起微乳結構向液晶相轉變[24]。醇類分子在油相中的溶解性提高會抑制水相或油相的極性調節作用，從而更容易產生液晶相[25]。此外，甘油作為助表面活性劑時微乳區域相對面積最小，可能是因為甘油的高黏度和低流動性導致其在水-油界面和水相中的穿透性降低[26]。因此，選擇無水乙醇作為助表面活性劑進行后續研究。

圖1 助表面活性劑對微乳液形成的影響Fig. 1 Effect of co-surfactant on microemulsion fabrication

2.2.2 表面活性劑對微乳液形成的影響

由圖2可知，不同表面活性劑的微乳區域相對面積由大到小依次為吐溫60＞吐溫80＞吐溫40＞吐溫20。這一結果與表面活性劑的結構有關，不同的吐溫系列表面活性劑，它們每一分子都有20?個環氧乙烷亞基，但疏水鏈的長度、脂肪酸類型和酯化程度不同，吐溫20和吐溫40的疏水鏈長分別為12和16，而吐溫60和吐溫80的疏水鏈長為18，但酯化程度有所區別[27-28]。除了以上的因素外，表面活性劑與助表面活性劑、油相的親和性也會影響微乳液的形成能力和穩定性[29]。因此，選擇吐溫60作為表面活性劑進行后續研究。

圖2 表面活性劑對微乳液形成的影響Fig. 2 Effect of surfactant on microemulsion fabrication

2.2.3Km對微乳液形成的影響

如圖3所示，微乳區域相對面積隨著Km的增大而增大，Km為3∶1時，微乳區域相對面積達到最大值45.49%。當Km為1∶2時微乳區域相對面積較小，可能是由于混合表面活性劑的乙醇含量較高，大部分的乙醇溶解于水相中，而沒有吸附在水-油界面膜上，這降低了界面膜的彈性，使微乳液穩定性下降[30-31]。而Km為2∶1和3∶1時，體系中的表面活性劑含量較高，它們被吸附到界面膜上，提升了界面膜的強度和穩定性，因此微乳區域相對面積較大[30-31]。盡管更大的Km可得到更大的微乳區域相對面積，但過高的表面活性劑用量可能會帶來安全性問題，Km為2∶1時微乳區域相對面積略小于3∶1時，且兩者都具有Smix＝9∶1和Smix＝8∶2兩條水無限稀釋線，為了穩定增溶更多的M.EO，因此，選擇Km＝2∶1和Smix＝8∶2進行后續研究。

圖3 Km對微乳液形成的影響Fig. 3 Effect of Km on microemulsion fabrication

2.3 M.EO-ME的構型表征

圖4表示微乳液隨水分質量分數變化下的電導率與黏度變化趨勢。電導率的變化可以揭示微乳液體系相轉變過程。在水分質量分數0～30%范圍內，電導率隨著水分質量分數的增加而緩慢增加，非離子型表面活性劑與油相將少量的水包裹、隔離，小水滴間很少發生碰撞與接觸，因此電導率增加緩慢，微乳液為油包水（water in oil，W/O）型[32]。在水分質量分數30%～60%范圍內，電導率隨著水分質量分數的增加而快速增加，此時小水滴開始相互碰撞與接觸，導電通道逐步完善，因此電導率快速增加，微乳液為雙連續（B.C型）構型[32]。在水分質量分數60%～90%范圍內，隨著水分質量分數增加，電導率增加緩慢，至水分質量分數為70%時達到最高值，隨后電導率逐漸下降，此時導電通道已經完全形成，水的增加只會使電導率緩慢增加，且當水分質量分數較大時，會起到稀釋作用，從而出現電導率達到最高值后發生下降的現象[32]，微乳液為水包油（oil in water，O/W）型。

隨著水分質量分數的變化而發生變化的黏度同樣可以表征微乳液的相轉變過程。與電導率類似的構型變化規律可以在黏度的變化中觀察到，在水分質量分數0～30%范圍內，黏度隨著水分質量分數升高而逐步升高，微乳液為W/O型；在水分質量分數30%～60%范圍內，黏度快速增加后又下降，形成鐘型曲線，微乳液為B.C型；在水分質量分數60%～90%范圍內，隨著水分質量分數增加，黏度緩慢下降，黏度處于較低的范圍，微乳液為O/W型。在B.C型區域得到最高的黏度，可能是因為水-油的聚集和內部聯結所致，而B.C型到O/W型轉變時，可觀察到黏度降至較低值，這表明了膠束結構的轉變[26]。

圖4 M.EO-ME電導率和黏度的變化曲線Fig. 4 Electrical conductivity and viscosity of M.EO-ME as a function of water content

圖5展示了水溶性染料亞甲基藍在微乳液中的擴散情況。與電導率、黏度的變化規律類似，當水分質量分數小于30%的范圍內，此時為W/O型微乳液，油相占據體系的主導，且密度比水小，因此亞甲基藍染料集中在底部；當水分質量分數達到30%～50%時，微乳液構型向B.C型轉變，隨著水分質量分數的增加，亞甲基藍染液在體系中的擴散范圍逐漸增大；當水分質量分數達到60%及以上，B.C型微乳液轉變為O/W型，水相開始占據體系的主導，亞甲基藍染料擴散得更充分、均勻。綜合以上結果以及微乳液構建的目的，選擇水分質量分數為70%的O/W型微乳液進行后續的研究。

圖5 亞甲基藍在不同水分質量分數M.EO-ME中的擴散情況Fig. 5 Methylene blue diffusion in M.EO-ME with different water contents

2.4 M.EO-ME的理化性質和稀釋穩定性

M.EO-ME的粒徑分布結果如圖6所示，M.EO-ME在稀釋前后均為單峰分布，對比原始狀態（即稀釋前），稀釋后的微乳液粒徑分布更集中。由表2可知，M.EO-ME電導率為260 μS/cm，具有較強的導電性；黏度較低，為8.19 mPags，說明體系具有良好的流動性。稀釋前的平均粒徑為（22.92±0.10）nm，PDI為0.36±0.00，說明體系粒徑較小，粒徑分布較為均一。稀釋后平均粒徑與PDI都出現顯著下降（P＜0.05）。由于微乳液的粒徑大小主要受界面組成和再分布影響，以上的結果可能是因為水相的增加，引起助表面活性劑乙醇在水相中的溶解量增加，總界面面積減小，即兩相界面上的乙醇量有所減少，導致粒徑變小，粒徑分布更為均一[33]。此外，微乳液在經100、200 倍稀釋后均未出現分層或絮凝等不穩定的現象。因此，M.EO-ME具有較好的稀釋穩定性。

圖6 稀釋前后的M.EO-ME的粒徑分布情況Fig. 6 Particle size distribution of M.EO-ME before and after dilution

表2 M.EO-ME的理化性質Table 2 Physicochemical parameters of M.EO-ME

2.5 M.EO及其微乳液的抗氧化活性評價

2.5.1 DPPH自由基清除能力

如圖7A所示，M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除率與精油含量呈劑量依賴效應，兩者的曲線類似，EC50分別為（1.43±0.07）、（1.27±0.11）mg/mL（以精油計）。由圖7B可知，M.EO經微乳化處理后DPPH值略有提高，微乳化前后的DPPH值分別為（29.37±5.71）μmol/g和（33.08±7.50）μmol/g，無顯著差異（P＞0.05）。由此說明，微乳液的構建并沒有影響M.EO的抗氧化活性。

圖7 M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除能力（A）和DPPH值（B）Fig. 7 DPPH free radical-scavenging capacity (A) and DPPH values (B)of M.EO and M.EO-ME

2.5.2 氧自由基清除能力和過氧自由基清除能力

為了研究微乳液對脂溶性精油的水溶性環境改善作用，運用水溶性的ORAC和PSC法以對比評價M.EO和M.EO-ME的抗氧化活性差異。

如圖8所示，M.EO和M.EO-ME的ORAC分別為（0.52±0.02）、（1.33±0.12）μmol/mg，PSC分別為（2.95±0.22）、（24.84±1.81）μmol/g。綜合ORAC和PSC結果可知，微乳液ORAC和PSC分別顯著提升為M.EO的2.6 倍和8.4 倍（P＜0.05），推測微乳液通過改善M.EO的水溶性，從而提高其在水溶性體系中的抗氧化活性。

圖8 M.EO和M.EO-ME的ORAC（A）和PSC（B）Fig. 8 ORAC (A) and PSC (B) of M.EO and M.EO-ME

ORAC和PSC方法采用更具生物學相關性的ABAP作為反應的自由基引發劑，能夠更好地評價抗氧化活性物對機體由氧自由基和過氧自由基引發的損傷的抑制效果，為M.EO-ME作為保健食品、藥物以及日化產品的開發利用提供一定的理論依據[34-35]。

2.6 M.EO和M.EO-ME對A375細胞的細胞毒性和抗增殖活性

M.EO和M.EO-ME對A375細胞毒性和抗增殖活性如圖9所示。對比對照組，M.EO和M.EO-ME的抗增殖活性呈劑量依賴關系。M.EO質量濃度為60～360 μg/mL時，細胞毒性最大為（7.26±1.46）%，低于10%，表現出極低的毒性，細胞增殖抑制率（100%－細胞增殖率）最大達（60.05±2.50）%。M.EO-ME質量濃度為10～70 μg/mL時，細胞毒性最大為（9.43±3.65）%，細胞增殖抑制率最大達（59.51±1.15）%，同樣在極小的毒性下表現出較好的抗增殖活性。本研究引入選擇指數（selective index，SI）以評價M.EO和M.EO-ME的安全性，SI是半數細胞毒性質量濃度（concentration cytotoxicity 50%，CC50）和抗增殖活性EC50的比值，用來反映藥物的安全性，若SI大于2，則說明抗增殖活性主要由抗增殖能力引起，反之則主要由細胞毒性作用引起[36]。M.EO和M.EO-ME的EC50分別為（257.10±14.59）μg/mL和（52.43±3.68）μg/mL（以精油計），M.EO-ME的EC50僅為M.EO的約1/5；兩者的CC50均未能得到確切數值，分別大于600 μg/mL和大于100 μg/mL（以精油計）；即SI分別大于2.33和大于1.92，根據兩者的SI，均可說明它們的抗增殖活性主要由抗增殖能力引起，且M.EO經微乳液包埋后，在毒性沒有明顯增大的情況下，其抗增殖效果有極大的提升，這可能是因為微乳液改善了M.EO的水溶性，以及表面活性劑的存在和其極小的粒徑有助于M.EO透過細胞膜發揮活性作用[37-38]。

圖9 M.EO（A）和M.EO-ME（B）對A375細胞毒性和抗增殖活性Fig. 9 Cytotoxicity and anti-proliferative activity of M.EO (A) and M.EO-ME (B) against A375 cells

3 結 論

本實驗使用水蒸氣蒸餾法提取得到M.EO，其主要組分經GC-MS分析確定為香樹烯（25.53%）、β-石竹烯（19.31%）、異石竹烯（11.30%）、甲位葎草烯（8.30%）、佛術烯（7.62%）。以M.EO為油相，運用偽三元相圖篩選確定吐溫60為表面活性劑，無水乙醇為助表面活性劑，Km＝2∶1，Smix＝8∶2的微乳液。微乳液經100、200 倍水稀釋仍保持穩定。最后，對比研究M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除能力、ORAC、PSC和抗腫瘤細胞增殖活性，發現微乳液在M.EO具有較好的抗氧化和抗腫瘤細胞增殖活性的基礎上，顯著提高了其ORAC、PSC以及抗腫瘤細胞增殖活性（P＜0.05）。本研究為涼粉草資源的高值化開發與利用提供了新的思路，為M.EO在保健食品、藥品和日化產品的開發利用提供了一定的理論參考。關于M.EO的抗增殖機理需要進一步的研究。