兩種澤蘭酸性多糖的結構和生物活性

張武霞，胡懿化，何嘉琦，王星滟，趙晉忠，李 鵬

（山西農業大學基礎部，中獸醫藥現代化山西省重點實驗室，山西 太谷 030801）

植物中豐富的活性多糖具有綠色天然、毒性低等獨特的優勢，因此被廣泛應用于食品和醫藥領域[1]。例如，枸杞多糖能夠促進雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，改善腸道健康[2]。五味子多糖能夠增強機體免疫力，上調血清中硒水平和白細胞介素（interleukin，IL）-2的表達，直接或間接地抑制腫瘤細胞生長[3]。大棗多糖通過促進淋巴細胞增殖和淋巴細胞因子分泌提高機體免疫功能[4]。柴胡多糖能夠降低炎癥因子水平和巨噬細胞氧化應激的產生，從而有效地抑制巨噬細胞衰老和炎癥衰老[5]。杜仲多糖可以通過增加機體的抗氧化因子活性，減少氧化應激對胰腺的損傷，從而改善胰腺組織的損傷[6]。研究發現多糖主要通過激活T、B淋巴細胞、巨噬細胞、補體和促進腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-6等細胞因子的生成來發揮免疫作用[7-8]。

澤蘭是多年生雙子葉草本植物，其莖葉經過炮制后可入藥，具有活血化瘀、行水消腫、改善血液循環和補養氣血的功效，現今已被納入保健食品原料（衛法監發[2002]51號文件）[9-10]。澤蘭中含有寡糖水蘇糖和α-低聚半乳糖混合物（alpha-galacto-oligosaccharides，GOS），水蘇糖能夠通過雙歧桿菌的選擇性增殖來平衡腸道微生態系統，GOS可顯著提高體液免疫，并增強脾淋巴細胞增殖[11]。目前對澤蘭中的多糖研究停留在粗多糖層面。因此本研究從澤蘭中分離酸性純多糖，利用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、化學比色法，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）以及紅外光譜對其分子質量、單糖組成等進行分析，并通過化學和免疫學方法對這兩種澤蘭多糖的體外抗氧化活性和細胞免疫調節活性進行初步評價，以期為澤蘭多糖的生物活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

澤蘭購買于安徽北銘藥業有限公司。

C57BL/6小鼠購買于山西醫科大學，動物生產許可證號：SCXK（晉）2020-0003，動物使用許可證號：SYXK（晉）2019-0001；RAW264.7細胞由西北農林科技大學段金友教授實驗室提供，最初購買于上海中國科學院細胞庫。

甘露糖（mannose，Man）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、巖藻糖（fucose，Fuc）、木糖（xylose，Xyl）、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、伴刀豆球蛋白（concanavalin A，ConA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 北京索萊寶公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）美國Sigma-Aldrich公司；小鼠TNF-α酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒美國Novus公司；核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）激活-核轉運試劑盒 上海碧云天公司。其他試劑藥品均為分析純級別。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外分光光度計 上海精科儀器廠；1260型液相色譜儀 美國安捷倫公司； TCS SP8型激光掃描共聚焦顯微鏡 德國Leica公司；DNM-9602型酶標分析儀 北京普朗新技術有限公司；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；515 HPGPC儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 澤蘭多糖的提取、分離及其純化

將干燥的澤蘭粉碎后，用體積分數為95%的乙醇溶液，80 ℃加熱回流2 h脫脂，蒸餾水80 ℃浸提2 h（固液比1∶10），重復操作3 次，收集合并濾液，進行濃縮。濃縮后，向其中加入4 倍體積的95%（體積分數）乙醇溶液，在低溫條件下沉淀24 h，使多糖完全沉淀后抽濾，收集多糖沉淀，蒸餾水溶解后透析（截留分子質量為1 000 Da）。透析后凍干獲得澤蘭粗多糖（記為LHP）。LHP分別用2 L蒸餾水和不同濃度的NaCl溶液（0.1、0.2、0.5 mol/L）進行梯度洗脫，經DEAE-52纖維柱（5 cmh50 cm，OH－型）分離純化，上樣量為15 mL，流速為0.5 mL/min，并用硫酸-苯酚法[12]檢測多糖含量，根據多糖含量分別收集0.1 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl洗脫組分，再用蒸餾水以0.2 mL/min流速洗脫，經SephadexG-100凝膠過濾柱層析分離純化后得到兩種純多糖，分別命名為LHPS1和LHPS5。

1.3.2 澤蘭多糖分子質量和化學組分的測定

1.3.2.1 分子質量的測定

多糖LHPS1和LHPS5的分子質量通過HPGPC測定[13]。7?種葡聚糖（5.2、11.6、23.8、48.6、148、273、410 kDa）為標準品（純度≥99%）。色譜條件：515 HPGPC儀（配備2414示差檢測器）；3 根分子排阻色譜柱（Ultrahydrogel 250（7.8 mmh30 cm，6 μm）、Ultrahydrogel 1000（7.8 mmh30 cm，12 μm）和Ultrahydrogel 2000（7.8 mmh30 cm，12 μm））串聯；洗脫液為3 mmol/L乙酸鈉溶液，流速為0.5 mL/min，進樣量為100 μL。根據洗脫峰的保留時間和對應葡聚糖分子質量得到的線性回歸方程，如式（1）所示。

式中：m為分子質量；t為保留時間/min。

1.3.2.2 化學組分的測定

分別用硫酸-苯酚法[12]、考馬斯亮藍法[14]和間羥基聯苯比色法[15]測定LHPS1和LHPS5的中性糖、蛋白質和糖醛酸的含量。

1.3.2.3 單糖組成的測定

利用柱前PMP衍生法，通過HPLC分析LHPS1和LHPS5的單糖組成[16]。將TFA加入多糖LHPS1或LHPS5溶液中振蕩混勻，110 ℃反應4 h，徹底水解為單糖，冷卻后旋蒸除去TFA，蒸餾水溶解得到多糖水解液。將50 μL多糖水解液或標準品溶液與等體積0.6 mol/L的氫氧化鈉溶液充分混合后，加入100 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液混勻，70 ℃反應100 min進行衍生化。鹽酸中和后，用氯仿多次萃取除去未反應的PMP，制備好的樣品溶液經0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC分析。以等物質的量的Man、Rha、GalA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc作為單糖標準品（純度≥99%）通過同樣方法衍生化并進行HPLC測定。HPLC色譜條件：C18色譜柱（250 mmh4.6 mm，5 mm），柱溫20 ℃，流動相A：15%乙腈＋85%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）；流動相B：40%乙腈＋60% PBS；PBS為pH 6.7、0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，紫外檢測波長為254 nm。各單糖的物質的量比參考文獻[17]計算。

1.3.3 紅外光譜分析

分別稱取2 mg冷凍干燥的LHPS1或LHPS5與KBr粉末混合研磨，壓片，用紅外光譜儀在4 000～400 cm－1波數范圍內進行掃描[18]。

1.3.4 澤蘭多糖體外抗氧化活性的測定

將LHPS1和LHPS5配成質量濃度分別為0.5、1、2、4、8 mg/mL的樣品溶液，參照文獻[19]測定LHPS1和LHPS5的總還原能力和DPPH自由基清除能力，評估兩種澤蘭酸性多糖的體外抗氧化活性。樣品總還原能力以700 nm波長處的吸光度A700nm表征，DPPH自由基清除能力以DPPH自由基清除率表征。

1.3.5 澤蘭多糖細胞免疫調節活性的測定

1.3.5.1 小鼠脾淋巴細胞增殖活性的測定

MTT法體外評估澤蘭多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響[20]。利用頸椎脫臼法處死小鼠，無菌取出脾臟置于100 目的篩網上，用5 mL注射器芯緩慢研磨，用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）洗滌2 次后，加入紅細胞裂解液裂解，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液后，用1640培養基洗滌2 次，將獲得的脾淋巴單細胞培養于1640培養基。終質量濃度分別為50、100、200 μg/mL的LHPS1或LHPS5作用小鼠脾淋巴細胞（1h107個/mL，90 μL/孔），以等體積的PBS為空白對照，以ConA（終質量濃度5 μg/mL）和LPS（終質量濃度2.5 μg/mL）為兩個陽性對照，孵育48 h后加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h，在600 nm波長處測定光密度值OD600nm以表征小鼠脾淋巴細胞增殖活性。

1.3.5.2 RAW264.7細胞吞噬能力和TNF-α質量濃度的測定

采用中性紅法測定RAW264.7細胞的吞噬能力[21]。將RAW264.7細胞（1h105個/mL）接種于96 孔板（90 μL/孔），分別加入10 μL LHPS1或LHPS5（終質量濃度分別為50、100、200 μg/mL）孵育24 h，再加入0.07%中性紅溶液孵育2 h。棄去培養液，PBS洗滌2 次。加入裂解緩沖液（1%（質量分數）冰醋酸-乙醇（等體積混合），100 μL/孔），在540 nm波長處測定OD值。分別以等體積PBS和LPS（2.5 μg/mL）作為空白對照和陽性對照。按式（2）計算吞噬指數。

式中：A加藥組為加入不同質量濃度澤蘭多糖或LPS溶液孵育24 h后測得的吸光度；A空白對照為加入PBS孵育24 h后測得的吸光度。

用LHPS1或LHPS5（終質量濃度分別為50、100、200 μg/mL）處理RAW264.7細胞24 h，以等體積的PBS為空白對照，LPS（終質量濃度2.5 μg/mL）為陽性對照。收集上清液，根據ELISA試劑盒的操作說明測定細胞上清液中的TNF-α的質量濃度。

1.3.5.3 甘露糖抑制劑處理

將RAW264.7細胞（5h105個/mL）接種到96 孔板（80 μL/孔）中。設置無Man預處理組和Man預處理組，LPS作為陽性對照。無Man預處理組先各加10 μL PBS作用1 h后，再分別加入10 μL PBS（空白對照）、LPS（25 μg/mL）、LHPS1（2 000 μg/mL）、LHPS5（2 000 μg/mL）；Man預處理組：提前加入10 μL Man（5 000 μg/mL）作用1 h后，再分別加入10 μL的PBS（空白對照）、LPS（25 μg/mL）、LHPS1（2 000 μg/mL）、LHPS5（2 000 μg/mL）。37 ℃孵育24 h后，使用ELISA試劑盒檢測培養上清液中TNF-α的質量濃度。

1.3.5.4 NF-κB激活-核轉運檢測

用NF-κB激活-核轉運試劑盒檢測LHPS1和LHPS5是否能夠激活RAW264.7中的NF-κB核轉錄因子。分別用200 μg/mL LHPS1、LHPS5和2.5 μg/mL的LPS處理RAW264.7細胞3 h，吸除培養液，洗滌和固定，用封閉緩沖液孵育細胞1 h。加入一抗NF-κB p65亞基孵育1 h后，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的山羊抗兔抗體G（H＋L）孵育1 h。4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）處理5 min后，用激光共聚焦顯微鏡觀察呈藍色熒光的細胞核和呈綠色熒光的NF-κB p65亞基。

1.4 數據統計與分析

結果以平均值±標準偏差表示。用GraphPad Prism 5軟件對數據進行處理。采用單因素方差分析對數據進行統計學分析，采用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結果與分析

2.1 澤蘭多糖的組成

2.1.1 分子質量和化學組成

LHPS1和LHPS5的HPGPC分析結果如圖1所示，樣品LHPS1和LHPS5分別在37.988 min和39.067 min出現較窄的吸收峰，說明這兩種多糖純度比較高。根據公式（1）計算得LHPS1和LHPS5的分子質量分別為1.13h105Da和7.40h104Da。

圖1 LHPS1（A）和LHPS5（B）的HPGPC圖Fig. 1 High performance gel permeation chromatograms of LHPS1 (A)and LHPS5 (B)

LHPS1和LHPS5的化學組成如表1所示，LHPS1主要成分是中性糖（（91.55f0.22）%），還含有（11.47f0.23）%糖醛酸。LHPS5主要含有中性糖、蛋白質和糖醛酸，質量分數分別是（28.38f0.14）%、（51.60f2.05）%和（12.43f0.33）%。兩種多糖中均含有一定量的糖醛酸，這說明LHPS1和LHPS5均是酸性多糖。

表1 澤蘭多糖分子質量及組分質量分數Table 1 Molecular masses and compositions of polysaccharides from Lycopi Herba

2.1.2 單糖組成

為了確定單糖的組成，用TFA水解LHPS1或LHPS5，用PMP進一步對水解產物進行柱前衍生化后，HPLC分析結果如圖2所示，LHPS1和LHPS5具有相似的單糖組成，都主要含有Man、Rha、GalA、Glc、Gal和Ara，但比例不同，LHPS1中Man、Rha、GalA、Glc、Gal和Ara物質的量比為13.05∶6.08∶1.83∶7.79∶55.32∶15.93，LHPS5中為17.65∶10.81∶12.52∶10.43∶25.54∶9.15。

圖2 單糖標準品（A）、LHPS1（B）和LHPS5（C）的HPLC圖Fig. 2 High performance liquid chromatograms of a mixture of monosaccharide standards (A), LHPS1 (B) and LHPS5 (C)

2.2 澤蘭多糖紅外光譜分析結果

如圖3所示，LHPS1和LHPS5分別在3 391.33 cm－1和3 299.7 cm－1處出現較寬的吸收峰，這說明它們結構中均含有羥基官能團。在1 640 cm－1附近有C＝O伸縮振動產生的吸收峰，說明LHPS1和LHPS5的結構中含有糖醛酸。此外，LHPS5在1 640 cm－1附近的透光率比LHPS1的大，結合表1結果分析可知，LHPS5在1 640 cm－1附近的峰還可能是蛋白質結構中酰胺鍵的伸縮振動引起的。在1 401 cm－1附近的吸收峰是由CüH的可變角振動引起的。在950～1 200 cm－1處的吸收峰是由CüOüC和CüO的伸縮振動引起的[22]。

圖3 LHPS1（A）和LHPS5（B）的紅外光譜圖Fig. 3 Infrared spectra of LHPS1 (A) and LHPS5 (B)

2.3 澤蘭多糖的體外抗氧化活性

通過體外補充抗氧化成分可以減輕氧化損傷和延緩衰老[23]。因此，從植物中研究篩選出抗氧化活性成分對于保護人類健康具有重要意義[24]。通過測定LHPS1和LHPS5的總還原能力和DPPH自由基清除率評估其抗氧化活性。結果表明LHPS1和LHPS5具有良好的體外抗氧化活性（圖4）。樣品總還原能力（A700nm）與樣品呈劑量依賴關系，這說明樣品溶液的還原能力隨質量濃度的升高而增強，LHPS5的總還原能力強于LHPS1（圖4A）。LHPS1和LHPS5 DPPH自由基清除能力（以DPPH自由基清除率表征）也隨樣品質量濃度的升高而增強。樣品質量濃度達到8 mg/mL時，LHPS1和LHPS5的DPPH自由基清除率達到最高，分別是54%和65%。此外，LHPS5 DPPH自由基清除能力也強于LHPS1（圖4B）。這些結果說明LHPS1和LHPS5具有成為抗氧化補充劑的潛能。

圖4 澤蘭多糖抗氧化活性評估Fig. 4 Assessment of antioxidant activity of polysaccharides from Lycopi Herba

2.4 澤蘭多糖的細胞免疫調節活性

2.4.1 澤蘭多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

脾淋巴細胞增殖活性是評估多糖免疫活性的重要指標[25]。如圖5所示，LHPS1和LHPS5能夠明顯促進脾淋巴細胞的增殖。LHPS1的促增殖能力呈劑量依賴增強，質量濃度為200 μg/mL時，LHPS1的促增殖能力最強。LHPS5在質量濃度為100 μg/mL和50 μg/mL時表現出最強的促增殖能力。

圖5 LHPS1和LHPS5對脾淋巴細胞增殖的影響Fig. 5 Effects of LHPS1 and LHPS5 on splenocyte proliferation

2.4.2 澤蘭多糖對RAW264.7細胞吞噬能力和TNF-α質量濃度的影響

先前研究表明在炎癥反應過程中最早產生的炎癥細胞因子TNF-α能夠激活淋巴細胞和中性粒細胞，同時能夠調節免疫反應并促進其他細胞因子的產生[26]。如圖6A所示，LHPS1和LHPS5能顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力。LHPS1和LHPS5顯著促進了RAW264.7細胞中TNF-α的產生，其中LHPS5的促進作用強于LHPS1（圖6B）。研究表明TNF-α表達失調和許多疾病有關，如阿爾茨海默癥、抑郁癥、銀屑病等[27-28]，因此，能夠促進TNF-α產生的LHPS1和LHPS5可能對這些疾病具有預防和治療作用。

圖6 LHPS1和LHPS5對RAW264.7細胞吞噬能力（A）和TNF-α分泌水平（B）的影響Fig. 6 Effects of LHPS1 and LHPS5 on the phagocytosis index (A) and TNF-α production (B) of RAW264.7 cells

2.4.3 甘露糖對澤蘭多糖激活RAW264.7免疫應答的影響

為了驗證Man受體（Man receptor，MR）是否參與LHPS1和LHPS5對RAW264.7細胞的激活作用，本實驗采用MR的抑制劑Man預處理RAW264.7細胞。如圖7所示，LHPS1和LHPS5（200 μg/mL）刺激Man預處理的RAW264.7細胞后，培養液中TNF-α質量濃度降低。這說明MR可能是RAW264.7細胞中LHPS1和LHPS5激活巨噬細胞的受體之一。單糖組成分析結果顯示兩種澤蘭多糖含有一定比例的Man，因此其可以和細胞表面的MR結合從而激活RAW264.7細胞分泌TNF-α。

圖7 Man對澤蘭多糖刺激RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響Fig. 7 Effect of mannose on TNF-α production in RAW264.7 cells stimulated by polysaccharides from Lycopi Herba

2.4.4 NF-κB激活-核轉運實驗結果

NF-κB是存在于動物細胞中的一種核轉錄因子，一般與NF-κB的抑制蛋白IκB以復合體的形式存在于細胞漿中。當細胞受到外界藥物刺激，復合體被激活后解聚，核定位序列暴露，被轉運到細胞核內識別靶基因上的結合位點，從而促使靶基因的轉錄[29]。

如圖8所示，LPS、LHPS1和LHPS5分別與RAW264.7細胞作用后，在RAW264.7細胞中觀察到所有刺激都導致NF-κB p65蛋白亞基（綠色熒光）移位到細胞核（藍色熒光）中，NF-κB被激活，這證明LHPS1和LHPS5都是有效的NF-κB激活劑，能夠參與細胞的炎癥反應、免疫應答等過程。結果表明，LHPS1和LHPS5能夠通過激活RAW264.7細胞的核轉錄因子NF-κB來增強巨噬細胞免疫活性。

圖8 LHPS1和LHPS5激活RAW264.7細胞中NF-κB p65蛋白Fig. 8 LHPS1 and LHPS5 activated NF-κB p65 in RAW264.7 cells

3 討 論

近年來，采用不同工藝手段從澤蘭中提取出粗多糖。例如，通過超聲提取、酶法提取和水提取等不同工藝提取的澤蘭粗多糖具有抗氧化的藥理活性[30-31]。本研究旨在提取分離出澤蘭中潛在的純多糖，并探討其結構和生物學活性。

本研究從澤蘭中鑒別出兩種酸性純多糖LHPS1和LHPS5。結果表明，LHPS1和LHPS5具有顯著的還原能力和DPPH自由基清除能力，這說明LHPS1和LHPS5與澤蘭粗多糖一樣具有抗氧化活性，并且還發現LHPS5的抗氧化能力強于LHPS1。此外，LHPS1和LHPS5能夠顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力，促進脾淋巴細胞的增殖和RAW264.7細胞中TNF-α的產生。研究報道植物多糖的生物活性與其單糖組成、分子質量、化學組成、構象、分支程度和官能團有關[32-33]。例如，水果桑葚由糖醛酸和7種中性單糖組成，可有效激活小鼠腹腔巨噬細胞，同時誘導包括TNF-α、IL-6和COX-2等其他免疫相關基因的表達[34]。類似地，高分子質量、高糖醛酸質量分數和豐富的單糖種類使LHPS1和LHPS5具有顯著的抗氧化活性和免疫調節活性，但由于LHPS1和LHPS5中中性糖、蛋白、糖醛酸質量分數和各種單糖比例不同，因此它們的抗氧化作用和免疫調節作用強弱也不同。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）介導髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）和NF-κB的這條信號通路（TLR-MyD88-NF-κB）是機體炎癥體系中最經典的途徑，在多種疾病的發生和治療過程中發揮重要的作用[35]。據報道，百合多糖[36]、小鹿藿根多糖[37]和黃芪多糖[38]能夠通過TLR4和MR介導的信號通路促進免疫反應中細胞因子的表達。LHPS1和LHPS5能夠激活RAW264.7細胞中的NF-κB，并且MR抑制劑能夠部分抑制其誘導的TNF-α的分泌，這說明LHPS1和LHPS5可以通過MR和NF-κB信號通路激活RAW264.7細胞發生免疫應答。此外，MR抑制劑不能完全抑制TNF-α的分泌，說明巨噬細胞上還存在其他可識別澤蘭多糖的受體。