乳酸芽孢桿菌發酵液護色的山藥多糖對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎的改善作用及機制

張慧瑩，曾麗萍，任運紅，杜 冰,2，黎 攀,2,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣東 廣州 510642）

山藥（Dioscorea oppositifoliaL.），又名薯蕷、土薯、淮山等，是我國傳統的藥食同源植物，味甘性平，入肺、脾、腎經，常用于治療脾虛食少，泄瀉久痢等。現代研究表明，山藥含有多糖、皂苷、糖蛋白、尿囊素等多種生物活性成分[1]，其中山藥多糖是公認的主要活性成分之一，它具有調節機體免疫、抗腫瘤、抗衰老、調節血糖、保護肝臟等藥理功能[2-4]。楊愷環[5]將不同濃度的山藥多糖溶液作用于結腸癌細胞HT-29，發現山藥多糖對結腸癌細胞HT-29呈現出濃度依賴性和時間依賴性的抗增殖作用，證實了山藥多糖的體外抗結腸癌活性。本課題組前期也從山藥中分離出一種水溶性多糖CYP-1，發現其能顯著抑制結腸炎小鼠炎癥相關基因的mRNA表達水平和促炎細胞因子的分泌，并能顯著調節結腸炎小鼠的腸道菌群，從而改善結腸炎，證實了山藥多糖的體內抗結腸炎活性[6]。

山藥極易發生褐變，護色處理是山藥加工過程的必要步驟。目前加工山藥時常用的護色處理是硫磺熏蒸，硫磺熏蒸不僅能抑制酶促褐變，還能抑制非酶褐變。盡管采用硫磺熏蒸能取得優良的護色效果，但極可能引發殘硫量超標的問題，這不僅會影響產品品質，甚至會引起食品安全問題[7-8]。乳酸芽孢桿菌DU-106是一種新型益生菌，具有高產左旋乳酸的能力[9]。本課題組前期研究表明，利用乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液對山藥進行浸泡處理也能達到優良的護色效果[8]。然而，不同的護色處理可能會影響山藥多糖的活性[10]，采用乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液對山藥進行護色這一新工藝會是否會影響其多糖的抗結腸炎活性目前仍不清楚。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）能造成小鼠結腸上皮損傷、內毒素入血、結腸水腫和過度炎癥，與臨床潰瘍性結腸炎病癥類似，是最常見用于構建結腸炎癥模型的物質[11]。本研究以DSS為誘導劑構建小鼠急性結腸炎模型，評估乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液護色山藥多糖的抗結腸炎活性并研究其機制，為山藥加工處理及含山藥多糖功能食品的開發研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性C57BL/6J小鼠（14～16 g，動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0137） 廣東質量監督檢察院。

飼料（標號：2019-05073） 廣東醫學實驗動物中心；乳酸芽孢桿菌DU-106（篩選自傳統發酵奶酪）華南農業大學新資源食品與功能性原料評價及研究中心；山藥（由華南農業大學食品學院杜冰教授鑒定，保藏于華南農業大學新資源食品與功能性原料評價及研究中心，保藏編號：2018-Du728） 廣州五山市場。

葡聚糖硫酸鈉 美國MP公司；糞便隱血試劑盒、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE） 上海源葉生物科技有限公司；乙醇 天津富宇精細化工有限公司；二甲苯 廣州化學試劑廠；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附試劑盒 深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HistoStar組織包埋機、HM340E石蠟切片機、Gemini AS自動染片機、CTM 6自動封片機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Lab.A1光學生物顯微鏡 德國卡爾·蔡司股份公司；DHP-600電熱恒溫培養箱 北京市永光明醫療儀器廠；FA2004A分析天平 上海精天電子儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 山藥處理及多糖提取

挑選大小一致、無創傷、無病蟲斑的山藥塊莖，用清水洗凈、切成2 mm左右厚的薄片，參考本課題組前期開發的護色方法[8]，將山藥分別浸泡于清水和體積分數10%的乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液中護色處理1 h，再置于70 ℃烘箱中烘干，得干山藥片。采用水提醇沉法[8]提取干山藥片中的粗多糖，粗多糖中清水護色的山藥多糖質量分數為79.63%，乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液護色的山藥多糖質量分數為79.50%。

1.3.2 構建DSS誘導的小鼠急性結腸炎模型

動物實驗嚴格按照華南農業大學實驗動物中心管理制度執行。40只雄性C57BL/6J小鼠在實驗環境（（20f4）℃、12 h的光照/黑暗循環交替）中適應性喂養一周后，隨機抽取10只為對照組，剩余30只為模型組。所有實驗小鼠給予充足的飼料，對照組小鼠自由飲用蒸餾水，模型組小鼠自由飲用質量分數3% DSS溶液，蒸餾水及溶液每2 d更換一次，連續7 d。每天對小鼠稱質量，并在第7天（造模后）參考張金玲等[12]的方法對小鼠進行疾病活動指數（disease activity index，DAI）測定，DAI由小鼠體質量變化程度、小鼠糞便性狀及糞便隱血評分3 項組成，其中糞便隱血評分由糞便隱血試劑盒測定，具體方法參照試劑盒說明書。

1.3.3 干預結腸炎小鼠及樣本采集

造模成功的小鼠隨機分為3 組：自然恢復組（DSS）、清水護色多糖組（CYH）、發酵液護色多糖組（CYF），每組10只，分別灌胃0.2 mL的蒸餾水、0.2 mL 300 mg/kgmb清水護色的山藥多糖溶液、0.2 mL 300 mg/kgmb乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液護色的山藥多糖溶液，劑量設置參考課題組前期研究[6]；對照組（CD）灌胃蒸餾水0.2 mL，連續7 d，期間自由飲用蒸餾水和食用飼料。每天灌胃前稱量小鼠體質量，觀察小鼠大便特征等，在第7天對小鼠進行眼球取血、離心，吸取上層的血清，－80 ℃保存、備用；小鼠腹部消毒后，取出完整結腸組織，用預冷（4 ℃）的生理鹽水沖洗2～3 遍，濾紙吸干水分后對結腸組織進行稱質量和長度測量。取距離肛門2 cm處的結腸組織6～10 mm放入體積分數10%中性福爾馬林溶液中，用于結腸組織病理學分析；沖洗出的結腸內容物置于－80 ℃保存，用于結腸內容物菌群分析。

1.3.4 小鼠血清促炎因子TNF-α水平的測定

用酶聯免疫吸附試驗試劑盒測定小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平。

1.3.5 小鼠結腸組織病理學分析

參考景亞萍[13]的方法制作病理切片，采用HE染色法對切片進行染色，采用樹膠封存，在顯微鏡下觀察結腸組織病理學變化并參考Dieleman等[14]的方法進行組織學損傷病理評分。

1.3.6 小鼠結腸內容物菌群分析

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取4 組小鼠結腸內容物的基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，檢測合格后進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。選擇擴增16S rRNA基因的V4區域，并對PCR產物進行混樣和純化，構建文庫后委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Ion S5TMXL測序平臺進行高通量測序。使用Cutadapt軟件過濾并按barcode拆分樣本后，采用多種方法對樣品數據進行挖掘和分析，分析小鼠腸道菌群結構及多樣性。

1.4 數據統計與分析

利用Excel 2020和GraphPad Prism 8軟件作圖，采用SPSS 17.0軟件對數據進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理后小鼠體質量和DAI變化

結腸炎可能導致小鼠飲食下降、皮毛松聳、活動減少，進而影響小鼠的體質量和DAI，在不處死小鼠的情況下，小鼠體質量和DAI的變化可以作為客觀指標反映造模期間小鼠的結腸炎病變程度[15]。如圖1A、B所示，以DSS為誘導劑喂養的模型組小鼠體質量增長明顯受到了抑制，DAI極顯著增加（P＜0.01），說明小鼠急性結腸炎模型構建成功，可以進行后續實驗。對建模成功的結腸炎小鼠給予山藥多糖干預，結果如圖1C、D所示，DSS組小鼠體質量極顯著低于CD組（P＜0.01），DAI極顯著高于CD組（P＜0.01），說明DSS誘導的結腸炎能明顯使小鼠消瘦，影響小鼠健康狀態；經山藥多糖干預后，CYH、CYF組與DSS組小鼠體質量無顯著差異（P＞0.05），CYH組小鼠的DAI顯著低于DSS組（P＜0.05），CYF組小鼠的DAI極顯著低于DSS組（P＜0.01），且CYH和CYF兩組小鼠DAI沒有顯著差異，說明發酵液護色的山藥多糖與清水護色的山藥多糖效果一致，乳酸芽孢桿菌發酵液護色的山藥多糖也有利于提升小鼠一般狀況，在一定程度上緩解結腸炎，但仍不能恢復至小鼠正常體質量。這可能是因為小鼠在結腸炎緩解過程中需要消耗大量的能量用于免疫細胞的增殖，恢復體質量仍需一段時間。

圖1 不同處理后小鼠體質量和DAI的變化Fig. 1 Changes in body mass and DAI of mice

2.2 山藥多糖對小鼠促炎因子分泌的影響

促炎因子的過度產生是結腸炎患者的典型特征，其中TNF-α是結腸炎病理進程中的關鍵細胞因子，會通過表達黏附分子、成纖維增殖因子、凝血因子以及啟動細胞毒性、凋亡和急性期反應等途徑加劇炎癥。由圖2可知，DSS組小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平極顯著高于CD組（P＜0.01），經山藥多糖干預后，CYH組和CYF組小鼠血清中的促炎因子TNF-α水平均極顯著低于DSS組（P＜0.01），且兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。說明乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖也能調節促炎因子TNF-α的分泌，從而改善DSS誘導的結腸炎，且效果與清水護色的山藥多糖相當。

圖2 山藥多糖對小鼠促炎因子TNF-α分泌的影響Fig. 2 Effect of Chinese yam polysaccharides on the secretion of inflammatory factor TNF-α in mice

2.3 山藥多糖對結腸炎小鼠結腸的影響

2.3.1 山藥多糖對結腸炎小鼠結腸長度和質量的影響

結腸炎可能會使得小鼠的結腸萎縮[16]，結腸質量和長度降低是結腸炎小鼠結腸萎縮的典型特征[17]。從圖3可知，DSS組小鼠的結腸質量、長度均極顯著低于CD組小鼠（P＜0.01），說明DSS組結腸炎小鼠結腸顯著萎縮。然而，CYH、CYF組小鼠結腸質量、長度均顯著高于DSS組小鼠（P＜0.05），且CYH和CYF兩組小鼠結腸質量、長度沒有顯著差異，這說明乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖也能改善DSS誘導的結腸萎縮，從而改善DSS誘導的小鼠結腸炎，且效果與清水護色的山藥多糖相當。

圖3 山藥多糖對結腸炎小鼠結腸質量（A）和長度（B）的影響Fig. 3 Effect of Chinese yam polysaccharides on colon mass (A) and length (B) in mice

2.3.2 山藥多糖對結腸炎小鼠結腸組織的影響

結腸組織充血、水腫、潰瘍和壞死等病變是結腸炎的典型特征。由圖4可知，CD組小鼠結腸黏膜光滑完整，上皮細胞整齊，能看到清晰的隱窩結構；DSS組小鼠結腸隱窩基本被破壞，炎癥細胞廣泛浸潤，病變位置深達肌層；CYH組和CYF組小鼠結腸中均能觀察到完整的黏膜下層結構，病變范圍也明顯減少。通過進一步切片分析，發現CYH組和CYF組間的病理評分無顯著差異（P＞0.05），但均顯著低于DSS組（P＜0.05），這說明乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖干預也可明顯緩解急性結腸炎小鼠的炎癥程度，減輕結腸炎小鼠的組織學損傷。該結果與上述的DAI、結腸長度和質量的結果保持一致。

圖4 小鼠結腸切片的HE染色圖和病理評分Fig. 4 Hematoxylin-eosin staining and histopathological scores of colon tissue in mice

2.4 山藥多糖對小鼠腸道菌群的影響

2.4.1α多樣性分析

由圖5A可知，小鼠腸道菌群的稀釋曲線隨測序數目增加趨于平坦，說明測序數據量合理，測序結果可以反映樣本中絕大多數的微生物信息[18]，箱型圖（圖5B）也驗證了該結論。由圖5C可知，在垂直方向上，4 組曲線均前端平滑程度較好，末端有部分曲折，說明物種分布較為均勻；在水平方向上，CYH組的曲線在橫軸上的跨度最大，其次為CD組、CYF組，DSS組最小，說明DSS處理降低了小鼠腸道菌群豐富度，兩種山藥多糖處理均能提高結腸炎小鼠的腸道菌群豐富度。腸道菌群豐富度降低是結腸炎患者的常見特征[19]。有研究表明，DSS處理會使腸道菌群的多樣性降低，改善DSS誘導的腸道菌群多樣性下降是緩解結腸炎的方法之一[20]，這提示乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖干預也有助于提高結腸炎小鼠腸道菌群多樣性，從而改善小鼠結腸炎。

Venn圖可用于統計多個樣本中共有及獨有的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），能夠相對直觀地反映樣本中物種的組成相似性及重疊情況。由圖5D可知，4 組樣品共有的OTU個數為469 個，分別占各組OTU數目的60.20%～77.27%，重疊度較高，說明4 組小鼠腸道菌群種類具有較高的相似性。DSS組與CD組共有521 個OTU，CYH組與CD組共有590 個OTU，CYF組與CD組共有546 個OTU，說明CYH組和CYF組小鼠的腸道菌群組成相比于DSS組與CD組更為相似，這提示乳酸芽孢桿菌發酵液護色的山藥多糖可能也可以調節DSS誘導的腸道菌群失調，使結腸炎小鼠腸道菌群組成接近正常小鼠。

圖5 小鼠腸道菌群多樣性分析Fig. 5 Diversity analysis of intestinal flora in mice

2.4.2 物種組成分析

腸道菌群失調被認為可能是結腸炎的發病機制之一[21-22]，使腸道菌群正常化是治療結腸炎的可能途徑[23-24]。由圖6A可知，在門水平上，4 組小鼠腸道微生物的OTU主要由10 個門構成：擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍細菌門（Cyanobacteria）、黑水仙菌門（Melainabacteria）及一個未定義菌門。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）占絕對優勢。厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度比值（F/B值）升高是腸道菌群失調的一個典型特征。由圖6B可知，DSS組小鼠的F/B值極顯著高于CD組（P＜0.01），說明經DSS誘導后，小鼠腸道菌群顯著失調；經多糖干預后，CYH組和CYF組小鼠的F/B值均顯著下降（P＜0.05、P＜0.01），說明經乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖也有利于恢復DSS誘導的急性結腸炎小鼠的腸道菌群失調。

由圖6C可知，在屬水平上，4 組小鼠腸道微生物OTU主要由30 個屬構成，比較CD組和DSS組在屬水平上物種豐度的差異發現，經過DSS誘導可降低以下益生菌的相對豐度：Lactobacillus、Blautia、Muribaculum、unidentified_Ruminococcaceae、Dubosiella、Akkermansia、Candidatus_Saccharimonas、Roseburia、Bifidobacterium、Enterorhabdus、Odoribacter、Ruminiclostridium；顯著增加以下有害菌的相對豐度：Bilophila、Parabacteroides、Alistipes、unidentified_Lachnospiraceae、Bacteroides、Parasutterella、Erysipelatoclostridium、unidentified_Enterobacteriaceae、Lachnoclostridium、unidentified_Erysipelotrichaceae、Faecalibaculum、Helicobacter、Oscillibacter、Anaerotruncus、Desulfovibrio。經山藥多糖干預后，部分在DSS組中相對豐度顯著降低的屬會有所回升，其中在CYH組和CYF組中相對豐度均有所回升的屬有：Muribaculum、unidentified_Ruminococcaceae、Dubosiella、Roseburia、Bifidobacterium、Enterorhabdus、Odoribacter、Ruminiclostridium，僅在CYF組中相對豐度有所回升的屬有：Lactobacillus、Candidatus_Saccharimonas，Gao Ruichang等[25]在研究鱘魚水解物對DSS誘導的結腸炎小鼠的影響中也觀察到了類似變化。

乳酸桿菌屬（Lactobacillales）和羅斯氏菌屬（Roseburia）是與調節機體免疫相關的菌屬[26-27]，DSS組小鼠腸道菌群中，這兩種菌的相對豐度均低于CD組，而通過山藥多糖干預的CYH組和CYF組Roseburia的相對豐度均有所提高，CYF組的Lactobacillales相對豐度也相應提高；擬桿菌屬（Bacteroides）和另枝菌屬（Alistipes）是常見的致病菌，它們與結腸炎的發生和惡化密切相關[28-29]，DSS組小鼠腸道菌群中，這兩種菌的相對豐度均高于CD組，而通過山藥多糖干預的CYH組和CYF組，Alistipes相對豐度有所降低，其中CYF組降低程度更大，CYF組的Bacteroides相對豐度也相應降低。這說明經乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖也能通過提高有益菌的相對豐度、降低有害菌的相對豐度，調節DSS誘導的腸道菌群紊亂，使結腸炎小鼠腸道菌群相對豐度與正常小鼠更為相似，從而達到改善小鼠結腸炎的目的。

圖6 小鼠腸道菌群物種組成分析Fig. 6 Analysis of species composition of intestinal flora in mice

圖6D是屬水平豐度聚類熱圖，該圖更加直觀地反映了各組小鼠腸道菌群相對豐度的差異，其結果與相對豐度柱形圖相似。CD組和DSS組小鼠腸道菌群相對豐度明顯不同，CYF組與CD組則較為相似，再次驗證了經乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖能夠調節DSS誘導的小鼠腸道菌群失調，從而改善小鼠結腸炎。

2.4.3β多樣性分析

β多樣性分析是對不同樣品或不同組間樣品的微生物群落構成的比較分析。主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和非加權組平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析是常見的β多樣性分析方法之一。在PCoA圖中，DSS組與CD組相距較遠，說明DSS誘導的結腸炎小鼠腸道微生物群落構成與CD組明顯不同，CYH組、CYF組與DSS組相距較遠，而與CD組相距較近（圖7A），說明與清水護色的山藥多糖效果一致，乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖干預也能恢復由DSS誘導的腸道微生物組成變化；在UPGMA聚類樹圖中，CD組先與CYF組聚為一類，再與CYH組聚為一類，最后與DSS組聚為一類（圖7B），說明經乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖干預后的結腸炎小鼠腸道菌群群落構成與正常小鼠最為相似，該結果不僅再次驗證了乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖干預能恢復由DSS誘導的腸道微生物組成變化，還提示乳酸芽孢桿菌發酵液護色后的山藥多糖對于調節由DSS誘導的小鼠腸道菌群紊亂可能效果更佳。

圖7 基于非加權Unifrac距離的PCoA分析（A）和UPGMA聚類分析（B）Fig. 7 Principal co-ordinates analysis (PCoA) (A) and unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster analysis (B)based on unweighted Unifrac distance

3 結 論

本研究從發酵液護色處理的山藥中提取了粗多糖，研究了該粗多糖的抗結腸炎活性及機制。主要實驗結論如下：1）乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液護色的山藥多糖也能顯著降低結腸炎小鼠的DAI、結腸質量、結腸長度和結腸組織學損傷病理評分（P＜0.05），且與清水護色處理的山藥多糖無顯著差異；2）乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液護色的山藥多糖也能顯著降低小鼠促炎因子TNF-α的分泌水平，且與清水護色處理的山藥多糖效果相當；3）乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液護色的山藥多糖也能通過提高結腸炎小鼠腸道菌群多樣性和有益菌的相對豐度，降低有害菌的相對豐度以及厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度比值，調節由DSS誘導的腸道菌群失調。在小鼠腸道菌群物種組成聚類分析中，CYF組與CD組腸道菌群結構更為接近。綜上，乳酸芽孢桿菌DU-106發酵液護色處理后的山藥多糖也能改善DSS誘導的小鼠結腸炎，其作用機制可能與調節促炎因子的分泌及調節腸道菌群有關。該結果可為山藥的加工以及含山藥多糖功能食品的開發研究提供理論依據。