低聚木糖對慢性腹瀉癥狀的改善作用

王沁玥，仝艷軍，劉登洋，吳順紅，劉二停，舒香玲，楊瑞金,*

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學附屬醫院，江蘇 無錫 214041；3.河南益常青生物科技有限公司，河南周口 466000）

腹瀉是一種常見的消化系統疾病，而腹瀉癥狀持續超過4周或反復發作時即為慢性腹瀉[1-2]。慢性腹瀉多見于慢性腸炎、腹瀉型腸易激綜合征、炎癥性腸病、腸道惡性腫瘤等腸道疾病，以急性感染性腹瀉病未徹底治療、遷延不愈最為常見。慢性腹瀉在老年人群中的發病率約為7%～14%[3]，兒童、免疫力低下患者亦為腹瀉的高危人群。糞菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是將健康宿主糞便中的功能菌群，通過口服、灌腸等方式移植到患病宿主腸道內，從而調節腸道菌群失衡，具備治療腸內外疾病的應用前景[4]，已被用于難辨梭狀芽孢桿菌感染、炎癥性腸病、頑固性便秘和代謝病等多種疾病的探索性研究和臨床治療[5-7]。

低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）是一類通過促進腸道有益微生物生長或活動從而維持宿主健康狀態的益生元，一般由2～7 個木糖分子通過β-1,4-糖苷鍵聚合而成[8]。XOS和其他的低聚糖相比，最大的優勢是穩定性強、耐酸耐熱，進入人體后不影響血糖濃度，適合糖尿病、高血壓患者服用[9]。XOS增殖雙歧桿菌的效果是低聚異麥芽糖、低聚果糖等益生元的20 倍，可以改善腸道動力[10]。XOS還具有抑制腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6等炎癥因子的產生、改善腸道健康等作用[11]。畜牧業領域，XOS已經用于動物腹瀉癥狀的改善，如斷奶仔豬[12]和牛犢等；臨床研究中發現，XOS可以緩解孕婦便秘，改善老年人胃腸功能[8]。因XOS應用于臨床慢性腹瀉的研究還存在許多空白，本研究擬通過隨機雙盲平行對照臨床試驗，對3 組患者分別用麥芽糊精、低劑量XOS、高劑量XOS進行干預。30 d后，分析各組患者各項生化指標的變化，隨后用3 組患者的糞菌液灌胃3 組小鼠，分析灌胃24 d后小鼠的相關情況，從而評估XOS對慢性腹瀉的效果，為慢性腹瀉癥狀的治療和預防打開新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6周齡雄性SPF級的昆明小鼠（體質量30～35 g）購買于北京斯貝福公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0010。

XOS（純度為96.95%）、安慰劑 河南益常青生物科技有限公司；實驗動物飼料 江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；無水乙醇、無水乙醚、乙酸（色譜級）、丁酸（色譜級） 國藥集團化學試劑有限公司；TNF-α、IL-10、閉鎖小帶蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）、緊密連接蛋白Occludin和D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）酶聯免疫吸附試驗試劑盒 南京森貝佳公司；糞便DNA提取試劑盒 美國Omega Bio-tek公司。

1.2 儀器與設備

JXFSTPRP-L型全自動樣品快速研磨儀 上海凈信公司；Mastercycle nexus GSX1聚合酶鏈式反應擴增儀 德國Eppendorf公司；NovaSeq高通量測序儀 美國Illumina公司；AU5800 Clinical Chemistry System全自動生化分析儀美國Beckman Coulter公司；GC-2010PLUS氣相色譜儀（配有全自動液體/頂空進樣器和氫火焰離子化檢測器）?日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床試驗對象的篩選

1.3.1.1 倫理審查及研究對象

實驗依據江南大學食品學院和江南大學附屬醫院倫理委員會的要求，撰寫倫理審查報告，報送至倫理委員會審議通過（倫理審查批號為LS2019030）。以2019年6ü12月在江南大學附屬醫院消化內科門診診斷有慢性腹瀉癥狀的患者作為研究對象。

1.3.1.2 納入標準

1）符合慢性腹瀉根據羅馬IV的診斷標準[13]：a）病程4周～2.5 年，平均（3.5f2.6）個月；b）有排便急迫感、排便頻率每日大于3 次，排便后腹部癥狀有所緩解；c）糞便性質稀薄（糞便性狀主要為Bristol5、6、7型）；d）平均最大腹痛嚴重程度為≥4。2）就診前已通過相關檢查確定無胃腸道等器官病變。3）慢性腹瀉非繼發于其他疾病。4）年齡≥18 歲。5）研究前至少一周內沒有進行相關治療以及沒有同時參加其他臨床研究。6）自愿參加本課題研究，簽署知情同意書并獲得醫學倫理委員會的批準。

1.3.1.3 排除標準

1）檢查發現為炎癥性腸病患者；2）患有I型或II型糖尿病、甲狀腺功能異常、嚴重抑郁癥、自身免疫性疾病、有癌癥或胃腸手術史、藥物或酒精濫用史、精神疾病史、嚴重傳染病等；3）近3 個月內服用抗生素3 d以上，或長期服用益生菌制品（包括食用酸奶和益生菌飲料）；4）腹瀉時有黑便、脂肪便、黏液便或血便，腹瀉時伴有發熱癥狀；5）近3 個月內做過胃腸鏡或其他腸道手術；6）對研究產品過敏的個體、孕婦、備孕期間的女性或哺乳期女性。

1.3.1.4 研究對象剔除和脫落

研究過程中服用抗生素、益生菌、結腸清潔藥物等3 d或以上；依從性差，未能遵循醫囑治療或在本課題研究期間參了加其他臨床研究；中途自行退出本課題研究；因各種原因失訪等。以上原因會使得研究對象被剔除。

1.3.2 臨床試驗對象分組與干預

本研究中慢性腹瀉患者隨機分為對照組（CK）、低劑量干預組（3X）、高劑量干預組（6X），其中CK組7 人，3X組8 人，6X組7 人，各組患者的基本信息均無明顯差異（表1），干預周期為30 d。每位患者入組后，由另外的工作人員（非研究人員）發放XOS或安慰劑。安慰劑主要含有糊精和少量的葡萄糖、麥芽糖。XOS和安慰劑均為白色或微黃色粉末，味微甜，均使用不透明無標識包裝袋密封包裝。對照組患者每人每天服用3 g安慰劑；低劑量干預組患者每人每天服用3 g XOS；高劑量干預組患者每人每天服用6 g XOS，每日晚餐后服用。每組患者在初入組（干預前）和干預結束時接受糞便和靜脈血樣采集，采集時詢問患者飲食、運動、排便情況，干預過程中跟蹤每位患者的動態（是否服用XOS/安慰劑、是否有不良反應、是否攝入抗生素）。入組患者和研究人員在整個干預期間保持雙盲狀態直到數據分析。

表1 各組患者的基本信息Table 1 Basic information of three groups of patients

1.3.3 臨床指標檢測

1.3.3.1 問卷調查評分

由患者個人在干預前和干預結束后根據腹痛癥狀、糞便形狀、胃口、排便次數、睡眠、口氣6 個方面進行0～3 分的程度評分，評分越高，癥狀越嚴重。

1.3.3.2 血清生化指標檢測

收集每位患者在干預前和干預后的靜脈血于惰性分離膠/促凝管，每管抽取約3～4 mL的血液并充分混勻，采用1 500hg、20 ℃，10 min的程序及時離心，隨后將血清分裝到0.5 mL離心管中。干預前后臨床樣本血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）在全自動生化分析儀上檢測。

1.3.3.3 糞便中短鏈脂肪酸測定

糞便中SCFAs的提取和分析方法參考文獻[14]。稱取凍干后的50 mg糞便，用500 μL飽和NaCl溶液重懸，加入40 μL 10%（質量分數）H2SO4酸化；加入1 000 μL無水乙醚，振蕩混勻，提取脂肪酸，然后12 000 r/min離心15 min；取上層乙醚相，加入0.25 g無水硫酸鈉進行干燥；靜置15 min后，12 000 r/min離心15 min，取上層乙醚相，裝入氣相小瓶中。采用氣相色譜法進行分析，根據標準品溶液含量通過外標法計算各樣品中乙酸和丁酸的含量。

1.3.3.4 糞便中總DNA的提取、擴增、測序

收集每位入組患者干預開始前和干預結束后的糞便樣本，冷凍保存在－80 ℃冰箱中，最后放置在干冰中運輸至上海宏序生物信息公司（中國）進行DNA提取、擴增、測序。

1.3.3.5 生物信息分析流程

為了提高分析結果的質量，在序列充足的同時，也要保證序列的質量，因此，分析前要先對原始數據進行過濾處理，得到優化序列。然后在去除嵌合體序列后進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，對OTU的代表序列作分類學分析。基于OTU聚類分析結果，可以對OTU進行多種多樣性指數分析，也可進行一系列群落結構變化的可視性分析。

線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）即LDA Effect Size，是尋找組間存在統計學差異的關鍵物種的方法。通過對標記出的組間特征物種豐度進行統計學分析，篩選出具有統計學差異的物種，再進行組間分析而得到不同水平的具有顯著性差異的物種。

1.3.4 糞菌移植小鼠實驗

采集臨床試驗患者干預30 d后的糞便樣品，置于滅菌的糞便采集管中。將每組患者的糞便混合后溶于0.01 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液中，制成200 mg/mL的FMT混懸液。剩下的樣品凍藏于－80 ℃冰箱。6周齡雄性SPF級的昆明小鼠飼養于江南大學實驗動物中心SPF級屏障設施中。小鼠隨機分為對照組（F-CK）、低劑量干預組（F-3X）、高劑量干預組（F-6X），每組6只，每只小鼠每日灌胃0.3 mL對應組別患者的FMT混懸液，共灌胃24 d。動物實驗倫理審查批號為JN.No20191230k0600630。

1.3.5 小鼠組織樣本采集

FMT混懸液共灌胃24 d，實驗第25天小鼠禁食12 h，眼眶取血后（室溫靜置2 h）血液于冷凍離心機中4 ℃、2 000 r/min條件下離心15 min，收集血清并分裝。小鼠采用頸椎脫臼法處死后，迅速解剖取出結腸、盲腸。其余組織臟器分裝后，保存在－80 ℃冰箱中備用。

1.3.6 小鼠結腸組織勻漿液細胞因子的測定

將小鼠結腸里的內容物清理干凈，取0.1 g結腸組織，剪碎后置于2 mL的無酶離心管，加入2 顆氧化鋯珠和1 mL的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），放入組織研磨儀中以65 Hz研磨45 s，研磨3 次至結腸組織呈流狀。結腸組織破碎完全后，在4 ℃、2 000 r/min條件下離心30 min。離心完成后取上清液作為待測樣本。全程冰浴操作，組織研磨儀的研磨模具需提前放入4 ℃冰箱中預冷。采用相應酶聯免疫吸附試驗試劑盒檢測TNF-α、IL-10、ZO-1、Occludin和D-LA水平，總蛋白含量用考馬斯亮藍法進行測定。

1.4 數據處理與分析

實驗結果采用平均值±標準差表示。采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析和作圖。采用單因素方差分析比較組間差異，采用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結果與分析

2.1 患者腹瀉癥狀評分變化

最終符合標準的慢性腹瀉患者中，CK組隨機分入7 人，3X組隨機分入8 人，6X組隨機分入7 人。在共計4周的干預過程中，3X組有1 人中途退出、6X組有1 人因服用了抗生素而被剔除，最后CK組7 人，3X組7 人，6X組6 人，共計20 人完成干預并計入最終分析。

根據干預前后的腹瀉癥狀評分（圖1），發現3X組和6X組在干預后的腹瀉癥狀評分均顯著下降（P＜0.05），安慰劑CK組也有下降，但無顯著性差異。故初步判斷XOS的干預使得腹瀉癥狀有所減輕。

圖1 干預前后患者腹瀉癥狀評分的變化Fig. 1 Changes in diarrhea symptom score of patients before and after intervention

2.2 患者血清生化指標變化

脂質代謝紊亂與腸道菌群失調密切相關，這種相關性腹瀉可能是因為過量脂肪酸刺激腸道造成的[15]，而TC、TG與脂肪酸的調節密切相關。陳麗雄等[16]等研究發現飼喂黃芪多糖后，繁殖獼猴的腹瀉數量下降，血清TC濃度從（2.60f0.88）mmol/L升至（2.91f0.58）mmol/L（P＞0.05）。何萍等[17]采用黃連素治療伴高脂血癥的腹瀉患者，干預后患者血清TG含量降低。如圖2所示，經過干預，CK組TC和TG濃度變化較小，XOS干預組TC濃度有升高趨勢，TG濃度呈下降趨勢，干預前后均無顯著性差異（P＞0.05），推測XOS有改善慢性腹瀉患者脂代謝的效果，但效果不顯著（P＞0.05）。

圖2 干預前后患者血清TC（A）和TG（B）濃度的變化Fig. 2 Changes in serum total cholesterol (A) and triglycerides (B)levels of patients before and after intervention

2.3 患者糞便短鏈脂肪酸含量變化

短鏈脂肪酸作為腸道菌群主要的代謝產物之一，對宿主代謝有重要的調節作用。普遍研究認為短鏈脂肪酸對宿主代謝的影響利大于弊，但一些特定情況下短鏈脂肪酸產量過高會危害宿主[18]。對患者干預前后的糞便短鏈脂肪酸進行分析，如圖3所示，XOS進行干預后，糞便中丁酸含量有上升趨勢，乙酸含量有下降趨勢，但均無顯著性差異。作為腸上皮細胞能量來源，丁酸可以滿足結腸黏膜上皮細胞的能量供給需要。而干預前患者的乙酸含量高于干預后，可能原因為慢性腹瀉患者腸道內發酵異常導致乙酸含量升高[19]。Ringel-Kulka等[20]研究發現腸內氣體增加和腸腔內pH值降低可能與腹痛癥狀產生有關，表明慢性腹瀉患者可能存在乙酸吸收障礙。

圖3 干預前后患者糞便中乙酸（A）和丁酸（B）含量的變化Fig. 3 The changes in acetic acid (A) and butyric acid (B) contents in feces of the patients before and after intervention

2.4 患者腸道菌群分析結果

2.4.1 腸道菌群的α多樣性變化

α多樣性通常表征腸道菌群的數量、種類、均勻度及進化關系，常用Shannon指數、Simpson指數進行表征。XOS對慢性腹瀉患者腸道菌群α多樣性的影響如圖4所示。其中Shannon指數越大表明群落多樣性和豐度越高。CK組在干預前后兩個階段的結果相近，未發生較大改變，而3X和6X組有較明顯變化趨勢。慢性腹瀉患者在XOS干預之后的腸道菌群多樣性增加，說明XOS有抑制腹瀉患者腸道菌群進一步失調的可能。

圖4 干預前后患者腸道菌群α多樣性指數的變化Fig. 4 Change in α diversity index of gut microbiota in patients before and after intervention

2.4.2 患者腸道菌群變化

如圖5A所示，在門水平上3 組患者腸道菌群仍以Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Actinobacteriota（放線菌門）以及Proteobacteria（變形菌門）為優勢菌門，不同個體間的各菌門的相對豐度存在一定差異。經過XOS干預后，3X組和6X組腸道中Firmicutes/Bacteroidetes比例提高，安慰劑干預后CK組反而上升。在對乳糜瀉兒童的研究中，將短雙歧桿菌作為飲食添加劑3 個月后，宿主體內Firmicutes/Bacteroidetes的比例從減少到恢復，Actinobacteria相對豐度增加，腸道菌群結構相對穩定[21]，與3X組的結果類似。在屬水平上，干預后3X組中Blautia、Megamonas、Bifidobacterium、Lachnospiraceae_unclassified相對豐度增加，Subdoligranulum相對豐度減小；干預后6X組中Blautia相對豐度增加，Escherichia-Shigella、Prevotella、Ruminococcus_gnavus_group相對豐度減小。Prevotella是人腸道微生物三大腸型代表菌之一，同時也是人腸道微生物的核心菌屬之一。相對研究表明，Blautia具有抗炎作用[22]，Ruminococcus_gnavus_group在炎癥性腸病患者腸道中富集[23]，Bifidobacterium作為益生菌可以調節腸內環境，由此可知，XOS可以增加腸道內的有益菌相對豐度，減少致病菌相對豐度，調節腸道微生態。

如圖5B、C所示，根據LEfSe結果計算lg LDA值并繪制分布柱狀圖，LDA值表示差異物種的影響程度，故物種的影響越大，對應直方柱的長度越長。3X組干預前的關鍵物種有Peptostreptococcaceae，6X組干預前的關鍵物種為Lachnospira；3X組干預后的關鍵物種有Actinobacteriota、Solobacterium、Mogibacterium、Saccharimonadales、Patescibacteria、Saccharimonadia、Abiotrophia，共7 個；6X組干預后的關鍵物種為Romboutsia。相關研究表明，厚壁菌門中Solobacterium顯示與結直腸癌風險降低相關[24]，Peptostreptococcaceae是與炎癥相關的物種[25]，Actinobacteriota作為產丁酸鹽物種可以減輕結腸炎癥[26]，Romboutsia與益生菌引起的腸道變化有關，有益生作用，可減輕大鼠的急性胰腺炎癥狀[27]。綜上所述，推測XOS可以通過調節腸道菌群來緩解結腸炎癥。

圖5 干預前后患者腸道菌群在門、屬水平的組成和LEfSe結果Fig. 5 Composition of gut microbiota in patients in different groups at phylum and genus level and LEfSe analysis

2.5 糞菌移植小鼠腸道通透性變化

D-LA是細菌發酵的代謝產物，當腸道屏障功能發生損傷時，腸道通透性增加，腸道黏膜絨毛上皮脫落，腸道細菌產生的大量D-LA通過受損黏膜，導致血清D-LA水平升高。與F-CK組相比，F-6X組血清中D-LA水平極顯著降低（圖6A）（P＜0.01），腸道通透性和損傷程度相比于F-CK組有所緩解，并且高劑量組干預效果更好。

緊密連接位于上皮細胞頂層及側邊的膜表面，形成細胞旁路密封層，可以調節離子、溶劑的進出，并維持細胞極性。對于維持腸道屏障完整性，細胞間的緊密連接和腸道黏液發揮了重要作用。而腸道屏障完整性缺失導致細菌抗原易位增加，刺激腸道黏膜的炎癥反應[28]。FMT小鼠結腸勻漿液中Occludin和ZO-1含量如圖6B、C所示。與F-CK組相比，F-3X和F-6X的ZO-1和Occludin含量有所增加，其中F-3X的ZO-1的含量顯著上升（P＜0.05），Occludin含量有增加趨勢（P＞0.05）。研究表明，腸道屏障功能相關蛋白ZO-1、Occludin的表達增加時會改善腸道屏障[29]。Yin Jie等[30]研究發現仔豬經XOS飼喂后，回腸中ZO-1表達量增加，腸黏膜通透性趨于正常，進一步說明XOS能使腸道黏膜功能和生物屏障趨于穩定狀態。

圖6 小鼠腸道通透性水平Fig. 6 Intestinal permeability level of mice

2.6 糞菌移植小鼠結腸炎癥因子變化

腹瀉患者體內的炎癥因子水平可以體現出腹瀉癥狀的嚴重程度，例如可調節腸道炎癥及嚴重程度[31]的TNF-α。IL-10作為抗炎因子，可下調菌群定植介導產生的黏膜炎癥因子[32]。血管生成素（angiopoiet，Ang）是一種腸道分泌的抗菌肽，浙江大學一院研究團隊發現Ang1可以調節腸道菌群平衡，維持腸道穩態，緩解結腸炎癥[33]。故本實驗結合3?種細胞因子的水平進行綜合分析，判斷FMT小鼠的腸道炎癥因子水平。

FMT小鼠的結腸炎癥因子水平的影響如圖7所示。與F-CK組相比，F-3X、F-6X組小鼠的結腸IL-10含量顯著增加（P＜0.01、P＜0.05）；Ang1質量濃度從（33.37f11.43）pg/mL分別增加至（71.14f22.91）、（57.03f20.72）pg/mL；TNF-α含量明顯下降，F-CK組與F-3X組差異顯著（P＜0.05）。由此可知，接受FMT后的小鼠腸道輕度炎癥得到緩解，其中F-3X組的改善效果更明顯。

圖7 小鼠結腸炎癥因子水平Fig. 7 Inflammatory factor contents in colon tissue of mice

3 結 論

本研究探討了XOS對慢性腹瀉的干預作用。攝入XOS后，腹瀉患者的腹瀉癥狀評分下降，脂代謝水平改善，糞便中丁酸含量增加，腸道菌群多樣性增加，有益菌的相對豐度增加，致病菌相對豐度減小。隨后將XOS干預后患者的糞菌液灌胃小鼠，發現小鼠的腸道屏障穩態趨于穩定，與F-CK組相比，F-3X、F-6X組小鼠結腸中IL-10和Ang1水平明顯增加，TNF-α含量明顯下降，輕微炎癥癥狀被緩解，腸道通透性相關指標D-LA質量濃度顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），緊密連接蛋白ZO-1的表達水平明顯上升，Occludin含量有增加趨勢（P＞0.05）。上述結果表明，XOS可以維持人體腸道屏障趨于穩定狀態，下調結腸炎癥水平，患者每天攝入3 g XOS對慢性腹瀉的改善效果相對更好。本研究為慢性腹瀉癥狀治療和預防打開新的思路，然而對具體的代謝產物和通路的確認還需運用代謝組學進行深入研究。