具有臨床降血壓功效的乳源三肽的研究進展

周會欽，肖軍霞，榮慶軍，譚海剛，孫 杰，黃國清,*

（1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島波尼亞食品有限公司，山東 青島 266109；3.山東省花生研究所，山東 青島 266109）

高血壓是人類常見的慢性疾病，是以體循環動脈血壓增高為主要特征，可伴有心、腦、腎等臟器功能或器質性損傷的綜合征。高血壓也是心血管疾病、腎衰竭和中風的主要危險因素，常與其他代謝性疾病如肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化等同時發生。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高以及飲食結構和生活習慣的改變，我國的高血壓發病率有所升高，且呈現低齡化趨勢。因此，對高血壓預防與治療方法進行研究對于提高人們的健康水平、減輕患者的經濟負擔具有重要意義[1]。

藥物是治療高血壓的主要方法，目前常用的高血壓治療藥物及方法包括β受體阻滯劑、利尿劑、鈣離子拮抗劑、血管緊張素轉換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制劑、腎素抑制劑、血管緊張素II受體阻滯劑、多巴胺I型受體激動劑及基因治療等[2]，其中ACE抑制劑類藥物能夠阻止血管緊張素I轉換為血管緊張素II，且對激肽酶活性有抑制作用，因此在臨床中被廣泛用于高血壓的治療。當前市場上銷售的ACE抑制劑類藥物如卡托普利、依那普利和賴諾普利都是人工合成類藥物，雖然它們具有較好的降血壓效果，但是會引起如咳嗽、味覺喪失和腎功能損害等多種副作用[3-4]。因此，尋找這些化學合成藥物的天然替代品對于高血壓的治療具有重要意義。

Ferreira等于1970年首次從腹蛇（Bothrops jararca）的毒液中提取得到了具有ACE抑制作用的活性多肽[5]，從此，降血壓肽（ACE inhibitory peptides，ACEIPs）開始引起了全球學者的廣泛關注。大量研究表明，來源于動物、植物、微生物和昆蟲的天然ACEIPs具有很好的ACE抑制活性，且對人體無毒副作用，因此在高血壓的預防與治療中具有廣闊的應用前景[6]。目前已有大量文獻對ACEIPs的來源[7-12]、結構與功能之間的關系[13]、生物利用度[14]、作用模式[15]、在功能食品開發中的應用[16]等進行了綜述?，F有的關于ACEIPs的研究多基于其體外ACE抑制活性或在原發性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）的體內降血壓活性，然而，目前尚未建立起這些體外或體內活性與在人體內實際降血壓功效之間的關系[17]。因此，雖然已有大量ACEIPs被分離和鑒定出來，但是經過臨床研究證實對人體具有體內降血壓功效且已在降血壓功能食品開發中獲得實際應用的僅有極少數幾種[16]，其中最受關注的是Ile-Pro-Pro（IPP）、Val-Pro-Pro（VPP）和Leu-Pro-Pro（LPP）3種三肽。

目前這3種三肽主要來源于牛奶中的酪蛋白，其中IPP位于β-酪蛋白的74～76位和κ-酪蛋白的84～86位，VPP位于β-酪蛋白的108～110位，LPP位于β-酪蛋白的151～153位[18]，因此這3種三肽又合稱為乳源三肽（以下簡稱乳三肽）。大量臨床研究及Meta分析表明，乳三肽可以有效降低高血壓患者的血壓[19-22]，對正常血壓沒有影響[23]，且可增加中老年人群的腦血流速度[24]，是非常理想的降血壓活性組件，可作為合成ACE抑制劑類藥物的補充或替代品。目前國外已有多種基于乳三肽的降血壓功能食品上市，而國內尚未發現相關產品。因此，本文就乳三肽的功效、安全性、制備方法和新來源等進行綜述，旨在為推動我國第三代降血壓功能食品的開發提供參考。

1 乳三肽的體外ACE抑制活性

大量研究表明，ACEIPs對ACE的抑制作用與其N端和C端的氨基酸殘基種類密切相關。當N端為疏水氨基酸，尤其是具有脂肪鏈的氨基酸（如Gly、Ille、Val和Leu時），C端為具有環狀結構的氨基酸（如Pro、Tyr和Trp時），ACEIPs的ACE抑制活性最強[25]。IPP、VPP和LPP的N端和C端氨基酸殘基種類均很好地滿足上述構效關系，這三者的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）分別為5.0、9.0 μmol/L和9.6 μmol/L，雖然遠遠高于常見的ACE抑制劑類藥物卡托普利的IC50（0.02 μmol/L）[26]，但是低于大部分已報道的ACEIPs[27]，因此具有很強的體外ACE抑制活性。一項體外研究證實，乳三肽可選擇性地抑制ACE1的活性，但對ACE2和胃促胰酶的活性無顯著影響[28]，這為乳三肽的實際應用提供了理論依據。

2 乳三肽的消化吸收

ACEIPs只有進入血液循環才能發揮降血壓功效。由于人體的胃腸道和血液中存在大量的蛋白酶和肽酶，很多ACEIPs在消化吸收過程中極易被水解而失去原先的結構和活性；另外，部分ACEIPs由于分子質量過大而無法直接被人體吸收。因此，ACEIPs能否以完整的結構被人體吸收是其能否發揮體內降血壓功效的關鍵[16]。研究發現，由于脯氨酸獨特的環狀結構會影響其與蛋白酶活性部分的結合，使得絕大部分蛋白酶都難以裂解Xaa-Pro或Pro-Pro肽鍵，因此在C末端存在一個或多個Pro殘基會使多肽耐受胃腸道蛋白酶的分解，并有利于多肽在后續的體內運輸過程中保持結構完整，從而使其進入血液循環并發揮體內降血壓作用[29-31]。乳三肽的C端均含有兩個Pro殘基，這為其抵御蛋白酶和肽酶的降解提供了結構基礎。

體外實驗證實，IPP和VPP對胃腸道消化酶具有很強的抗性[32]，且兩者均能以完整結構通過Caco-2單層細胞[33]。以豬為實驗對象，對IPP、LPP和VPP的藥代動力學進行研究，發現它們均可以被完整地吸收進入血液循環，且當以靜脈注射的方式給藥時，IPP、LPP和VPP的消除半衰期分別為（2.5f0.1）、（1.9f0.1）min和（2.0f0.1）min；當以口服方式給藥時，這3種三肽的半衰期則無顯著差異，分別為（9f1）、（15f4）min和（12f6）min[34]。人體實驗也充分證實了這一結論，當受試人群攝入含有IPP和LPP的飲料后，這兩種三肽均能夠被完整地吸收進入血液循環，且與膳食同時攝入有利于提高這兩種三肽在血液中的含量[35]。

3 乳三肽的臨床降血壓效果

根據國際高血壓協會于2020年頒布的《全球高血壓實踐指南》，可將人體的血壓分為如下幾個等級，其中，正常人的血壓收縮壓為90～140 mm汞柱，舒張壓為60～90 mm汞柱；輕度高血壓患者收縮壓為140～159 mm汞柱，舒張壓為90～99 mm汞柱；中度高血壓患者收縮壓為160～179 mm汞柱，舒張壓為100～109 mm汞柱；重度高血壓患者收縮壓大于等于180 mm汞柱，舒張壓大于等于110 mm汞柱。目前已有大量Meta分析和綜述對乳三肽，尤其是IPP和VPP，在雙盲安慰劑對照試驗中對高血壓患者的血壓干預作用進行了總結[36-37]。結果表明，持續4～8周每日攝入2～10 mg含有IPP和VPP的飲品可以顯著降低受試者的血管收縮壓和舒張壓[21,38-40]。

Hata等在一項安慰劑對照研究中發現，讓30多名40～86 歲的高齡高血壓患者連續8周每天攝入95 mL含有IPP和VPP的可爾必思酸奶（日本東京可爾必思食品工業有限公司）后，患者的收縮壓下降了（14.1f3.1）mm汞柱（P＜0.01），舒張壓下降了（6.9f2.2）mm汞柱（P＜0.01），而安慰劑對照組的血壓沒有顯著變化[41]。Aihara等讓40 名正常高值血壓受試者和40 名輕度高血壓患者連續4周每天攝入6 片含IPP和VPP的瑞士乳桿菌CM4（Lactobacillus helveticusCM4）發酵酸奶片，發現兩個實驗組受試對象的收縮壓和舒張壓與安慰劑組相比均顯著下降，其中正常高值血壓組與安慰劑組相比舒張壓顯著下降了5.0 mm汞柱，而輕度高血壓患者組的收縮壓下降了11.2 mm汞柱[42]。Turpeinen等進行了一項為期10周的雙盲安慰劑對照干預實驗，62 名輕度高血壓受試者每天攝入含有4.2 mg IPP和VPP的涂抹醬后，收縮壓顯著下降了5.0 mm汞柱[43]；隨后Turpeinen等又對104 名年齡在35～60 歲之間的歐洲高血壓高膽固醇患者進行干預試驗，同樣攝入含有4.2 mg IPP和VPP的涂抹醬，發現試驗組的收縮壓與安慰劑組相比顯著下降了3.6 mm汞柱（P＝0.007）[39]。Nakamura等就乳三肽對日本高血壓患者的降血壓效果進行了研究，70 名年齡50～69 歲的高血壓患者每天攝入含有3.4 mg VPP和IPP的藥片，持續8周后實驗組的收縮壓下降了（11.0f11.0）mm汞柱，而安慰劑組下降了（4.5f9.6）mm汞柱[44]。Kajimoto等設計了一項針對輕度高血壓患者的雙盲安慰劑對照試驗，64 名年齡在39～61 歲的受試者連續每天攝入含有IPP和VPP的酸奶飲料（每瓶150 g，每天2 瓶），8周后發現實驗組受試者的收縮壓和舒張壓與安慰劑組相比分別高度顯著下降了（13.9f11.4）mm汞柱（P＜0.001）和（9.1f7.5）mm汞柱（P＜0.001）[36]。Chanson-Rolle等以日本人群為受試對象，發現每天攝入一定量的IPP和VPP有效降低了受試者的血管收縮壓（－5.63 mm汞柱，P＜0.000 1），且這兩種三肽對高血壓患者的降壓效果要顯著好于對非高血壓患者[45]。Hirota等讓25 位患有輕度高血壓的男性受試者每天攝入含有VPP和IPP的酪蛋白水解物，1周后測量左上臂的反應性充血情況，發現含有VPP和IPP的酪蛋白水解物可以顯著改善輕度高血壓患者的血管內皮功能障礙[38]。

由上述研究可知，乳三肽，尤其是IPP和VPP具有明確的體內降血壓功效。這些臨床研究結果為基于乳三肽開發具有明確功效的第三代降血壓功能食品奠定了堅實的基礎。表1對部分關于乳三肽臨床降血壓功效的研究進行了總結。

表1 乳三肽的臨床降血壓效果總結Table 1 A summary of the clinical antihypertensive effect of lactotripeptidess

4 乳三肽的其他功能

除了降血壓作用外，乳三肽還被發現具有其他多種生理功能。

4.1 改善血管內皮功能障礙

VPP和IPP可以抑制血管平滑肌細胞的增殖、降低由血管緊張素酶II誘導的細胞促炎介質（cyclooxygenase-2，COX-2）和超氧化物的含量，且VPP比IPP的效果更為顯著[46]；Song Tianyuan等也發現了這兩種三肽活性的差異，且認為這種差異主要是兩者N端氨基酸殘基種類的不同所致[47]。Hirota等發現，在離體條件下，去除主動脈的內皮細胞后，VPP和IPP干預均未引起血管舒張，表明這兩種三肽是通過影響內皮細胞來引起血管舒張[48]。J?k?l?等以SHR為實驗對象，也發現VPP和IPP可以改善血管內皮功能障礙，有利于腸系膜動脈內皮依賴性舒張[49-50]。體內研究也證實了上述發現，Hirota等讓輕度高血壓患者連續1周攝入含有VPP和IPP的酪蛋白水解物后，發現受試者的血管內皮功能障礙得到了顯著改善[38]。

4.2 促進血管擴張因子釋放

一氧化氮（nitrogen oxide，NO）是一種有效的內源性血管舒張物質，在保護心血管健康中發揮著重要作用[51-52]。研究發現，IPP和VPP也可以誘導NO的產生，從而改善I期高血壓患者的血管內皮功能[38,47,53]。

Nonaka等將IPP和VPP與N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽混合后添加到正常大鼠的飲用水中，發現與未添加這兩種三肽的對照組相比，實驗組大鼠血漿中亞硝酸鹽和硝酸鹽（NOx）的水平顯著增加，這對于緩解實驗大鼠的動脈功能障礙、血管僵硬和靶器官損傷具有積極影響[53]。還有報道證實IPP、VPP可以通過誘導產生NO以修復血管內皮細胞損傷[48,54]以及誘導離體主動脈細胞產生NO，進而引起主動脈血管舒張[48]。有學者通過DNA芯片技術分析了IPP和VPP對SHR體內降壓效果的機理，發現這兩種多肽可以顯著增加內皮型一氧化氮合酶基因的表達[55]。

4.3 類胰島素功能

高血壓和糖尿病這兩種代謝綜合征具有共同的病理，都能引起損傷血管，且長時間患糖尿病易誘發心腦血管疾病，因此，IPP和VPP的攝入與胰島素水平的關系也引起了部分學者的關注[56-58]。最近研究發現，IPP和VPP可以通過增強胰島素信號的傳導和抑制炎癥對胰島素的干擾從而調節胰島素水平，進而對高血壓的控制產生有利的影響[59-60]。Chakrabarti等以小鼠前脂肪細胞（3T3-F442A）為研究對象，發現IPP和VPP可以誘導脂肪發生分化、上調轉錄因子表達和脂聯素的釋放，還能夠抑制細胞因子介導的炎癥[61]，且增加了3T3-F442A細胞對胰島素的敏感性[62]。

4.4 降低交感神經活動

高血壓對交感神經也會產生一定的影響。Miyazaki等以SHR為研究對象，發現攝入IPP和VPP后實驗大鼠的皮膚動脈交感神經活動和平均動脈壓均顯著降低[63]；Usinger等在人體中也觀察到了類似的現象，受試者連續8周每天攝入由瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）發酵的含IPP和VPP的酸奶后，其交感神經活動顯著減弱[64]。

5 乳三肽的安全性

由于IPP、VPP和LPP主要存在于水解物中，因此目前對這3種三肽的安全性研究主要以相應的水解物為對象。Tensguard?是由荷蘭DSM公司開發的一種富含IPP的乳蛋白水解物，具有顯著的降血壓功效。Ponstein-Simarro Doorten等對該水解物進行了細菌反向突變試驗、哺乳動物細胞基因突變試驗、哺乳動物染色體突變試驗以及大鼠90 d重復劑量口服毒性研究，發現該水解產物不具有致畸或致突變作用，口服毒性試驗則表明在選擇的最高測試劑量下（40 mg IPP/（kgmbgd））仍然是安全的[65]。Maeno等以倉鼠為對象進行染色體畸變實驗，發現攝入IPP和VPP不會誘導細胞毒性或染色體異常[66]。Dent等則就IPP和VPP對大鼠進行了為期90 d的重復灌胃毒性研究，并以兔子為對象研究了這兩種三肽對產前胚胎和胎兒發育的影響，發現在測試的最高劑量（33.6 mg IPP/（kgmbgd））下兩種實驗動物均未出現不良反應[67]。Mizuno等給24只大鼠連續91 d灌胃劑量分別為0、40、200、1 000 mg含有0.6% IPP和VPP的酪蛋白水解物，均未出現行為和臨床體征上的異常，解剖后發現器官和組織病理學也未發生顯著變化[68]。

IPP和VPP的有效降血壓劑量可能由于人群、地域、年齡、飲食習慣以及高/輕度血壓癥狀的不同而有差異，普遍認為IPP和VPP的有效低劑量小于10 mg/d[69]，一般認為在3.07 mg/d左右，但是當乳三肽的劑量高達52.5 mg/d時人體也不會出現任何不良反應[70]。

乳三肽對人體的安全性已被大量臨床研究所證實。Hata等發現，30多名高血壓患者在連續8周每天攝入95 mL含有IPP和VPP可爾必思酸奶后，脈搏率、體質量和血清生化指標均無明顯變化[41]。Aihara等也觀察到了同樣的結果，受試者在連續4周攝入含有IPP和VPP的發酵酸奶片后，脈搏率、體質量和血清生化指標均無明顯變化，也未出現其他不良反應[42]。Nakamura等發現，受試者攝入含有3.4 mg VPP和IPP的藥片后均未出現咳嗽、疲勞、頭痛和痛風等合成ACE抑制劑類藥物常出現的不良反應[44]；Kajimoto等也發現受試者在每天攝入300 g含有IPP和VPP的酸奶飲料8周后，均未出現干咳、消化異常等不良反應，血清標記物和尿酸水平等指標也未出現明顯變化[36]。Turpeinen等發現，來自歐洲的受試者攝入含IPP、VPP和植物固醇的涂抹醬后，其收縮壓和血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平均顯著降低，但是未出現其他不良反應[39]。

由上述動物實驗和人體研究可知，在合理的劑量范圍內，乳三肽具有良好的安全性。

6 基于乳三肽的降血壓功能食品

目前國外市場上已有多種基于乳三肽的降血壓功能食品上市，產品形式多為片劑、膠囊或發酵酸奶。TensguardTM是由荷蘭DSM公司最新開發生產的一種乳蛋白水解物，該產品富含IPP，可用于維持心血管健康及保持血壓在正常范圍[65]。日本可爾必思食品工業公司生產的Calpis?酸奶由瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發酵牛奶制得，富含IPP、VPP和LPP，據稱其“適用于輕度高血壓者”，該產品在日本已經暢銷20多年，是眾多患有高血壓人士每天必不可少的降壓保健食品，并且可以和降壓藥物同時服用；該公司在Calpis?酸奶的基礎上又開發了具有降血壓功效的酪蛋白水解物AmealPeptide?，該產品以片劑的形式銷售，每片含LPP和VPP共1.7 mg，建議服用量為每天2 片。芬蘭瓦利奧（Valio）公司也推出了具有降血壓功能的、由瑞士乳桿菌發酵的酸奶制品Evolus?，該產品于2000年上市，深受歐洲消費者歡迎，被稱為“第一個有助于降低血壓的歐洲功能性食品”[71]。

7 乳三肽的制備方法

乳三肽最早從瑞士乳桿菌和釀酒酵母共同發酵的酸奶中分離鑒定[72]。隨著人們對乳三肽功能了解的深入，乳三肽的制備方法也日益豐富。目前已報道的乳三肽生產方式主要分為3種：胃腸液消化法、瑞士乳桿菌發酵法和酶解法。

7.1 胃腸液消化法

酪蛋白在體內的消化過程可分為兩個階段，首先經消化酶（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶）進行“I期消化”，隨后在腸上皮細胞通過刷狀緣肽酶進行“II期消化”。腸上皮細胞刷狀緣含有豐富的肽酶，可以將“I期消化”產生的多肽進一步水解成寡肽（二肽、三肽）甚至氨基酸。胃腸道消化系統能否直接水解酪蛋白釋放乳三肽已經引起了學者們的廣泛關注。體外研究表明，β-酪蛋白通過胃腸道消化后可釋放出含有IPP和VPP序列的前體，但并不能直接釋放出這兩種三肽[32]；但在另外一些研究中則得到了相反的結論。Tagliazucchi等利用COST Action Infogest體外消化模型對駱駝奶中的κ-酪蛋白進行水解，成功在水解液中檢測到了IPP的存在，且其質量濃度達到了（2.56f0.15）mg/L[73]；Rutella等利用該模型成功從脫脂牛奶中得到了VPP和IPP，且兩者的質量濃度分別為（354.3f29.8）μg/L和（973.8f155.7）μg/L[74]；在牛、駱駝、綿羊和山羊奶的體外消化實驗中得到了相似的結論[73,75-76]。一項臨床試驗證實了上述發現，受試者在攝入了不含游離IPP的乳清分離蛋白后，血漿中的IPP濃度顯著增加，表明人體內的胃腸道消化系統可水解乳清分離蛋白并釋放出IPP[77]。

7.2 瑞士乳桿菌發酵法

目前富含IPP、VPP和LPP的功能食品（包括酸奶、奶酪以及風味乳飲料）主要以酪蛋白為原料通過瑞士乳桿菌發酵制得[78]。瑞士乳桿菌具有很高的胞外胞內蛋白酶活性，因此被廣泛用于發酵牛奶以生產富含IPP、VPP和/或LPP的水解產物。

7.2.1 瑞士乳桿菌的蛋白水解系統

瑞士乳桿菌在發酵過程中要需要在自身蛋白酶水解系統的作用下水解酪蛋白，以產生供自身生長繁殖所需的營養物質，IPP、VPP及LPP即在此過程中被釋放出來[79-81]。在眾多乳酸菌菌株中，瑞士乳桿菌具有最高的細胞包膜蛋白酶活性[81]。Edens等發現瑞士乳桿菌的細胞包膜蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，這類蛋白酶具有專一性和高效性，這也是瑞士乳桿菌具有極強蛋白質水解活性的重要原因[29]。酪蛋白經瑞士乳桿菌發酵水解生成生物活性肽主要由3 個系統起作用，即細胞包膜蛋白酶水解系統、細胞膜上的寡肽轉運系統和胞內酶水解系統[80,82-83]。第一個系統將酪蛋白水解成由3～30 個氨基酸殘基組成的寡肽，第二個系統將這些寡肽通過細胞膜上的肽轉運系統轉運到細胞內，第三個系統則在細胞內將寡肽通過胞內蛋白酶水解為含2～5 個氨基酸片段的小肽（包括IPP、VPP和LPP）甚至是氨基酸[83]。

7.2.2 瑞士乳桿菌的細胞包膜蛋白酶

不同瑞士乳桿菌菌株的細胞包膜蛋白酶活性存在差異。Wakai等發現瑞士乳桿菌CM4和瑞士乳桿菌DPC4571的細胞包膜蛋白酶活性不同，進而導致了兩者在發酵酸奶時產生IPP和VPP的含量也不同[84]；進一步研究發現，從瑞士乳桿菌菌株CP790中分離純化得到的細胞包膜蛋白酶水解α-和β-酪蛋白時無法得到IPP和VPP[85]，但是瑞士乳桿菌CP790和瑞士乳桿菌CM4的細胞外蛋白酶水解酪蛋白時產生了一個包含IPP和VPP序列的、由28 個氨基酸殘基組成的多肽[85]。這表明欲從酪蛋白中水解得到IPP和VPP，除了細胞包膜蛋白酶外，還需要其他蛋白酶的參與。

7.2.3 瑞士乳桿菌的細胞內蛋白酶

在瑞士乳桿菌CM4菌株中檢測到了可水解C-末端脯氨酸的肽酶，該酶是加工生成IPP和VPP的關鍵[86]。Griffiths[79]、Wakai[87]等發現欲從酪蛋白中獲得IPP和VPP，還需要對肽的N-末端進行切割，且當N端氨基酸殘基為脯氨酸時氨肽酶的水解會終止。X-脯氨酰二肽氨基肽酶（pepX）能夠從多肽的N-末端切割兩個氨基酸并釋放具有Xaa-Pro序列的二肽[88-89]，但是當Xaa-Pro-Pro序列存在時，氨肽酶停止水解[79]。因此，水解酪蛋白產生VPP和LPP需要多種蛋白酶和肽酶的協同作用。已經在不同的瑞士乳桿菌菌株中發現了多種肽酶，包括氨肽酶（pepC1、pepC2、pepN、pepN2、pepA）、pepX、內肽酶（pepE、pepE2、pepF、pepO、pepO2、pepO3）、三肽酶（pepT、pepT2）、二肽酶（pepD1、pepD2、pepD3、pepV、pepDA）[82-83,87]等，這些酶在乳三肽的定向水解中發揮了重要作用，這也是瑞士乳桿菌被廣泛用于乳三肽制備的重要原因之一。

瑞士乳桿菌的蛋白水解系統及水解過程如圖1所示。

圖1 瑞士乳桿菌蛋白水解系統的示意圖[78,82]Fig. 1 Schematic diagram of protein hydrolysis system of Lactobacillus helveticus[78,82]

7.3 酶解法

由于瑞士乳桿菌蛋白水解能力強、蛋白酶種類豐富，尤其是富含多種脯氨酸特異性的肽酶，因此在乳三肽的制備中具有獨特的優勢。但是微生物發酵法存在明顯缺點，首先，發酵使用的乳酸菌是活生物體，其分泌酶的類型和數量難以控制，生產過程的重現性較差；其次，發酵過程時間較長，易發生微生物污染；此外，發酵產品不宜直接摻入固體食品中[29]。

相比于發酵法，蛋白酶水解法生產工藝簡單、產品質量易于控制、成本相對較低，因此是一種更加經濟可行的乳三肽生產方法。酶解法制備乳三肽的關鍵在于尋找可以切割含有X-Pro-Pro序列的蛋白酶。Mizuno等使用9種市售的蛋白酶水解酪蛋白，發現來自米曲霉（Aspergillus oryzae）的蛋白酶Sumizyme FP的水解產物中存在大量Xaa-Pro-Pro和Xaa-Pro序列[90]；對Sumizyme FP進行進一步分離純化，得到了一種內肽酶（neutral protease I，NP I）和一種氨肽酶（leucine aminopeptidase，LAP），其中前者具有羧肽酶活性，后者具有氨肽酶活性，兩者單獨作用不足以使酪蛋白水解釋放出IPP，但是兩者協同作用可以成功水解酪蛋白產生IPP，這表明NP I和LAP是水解酪蛋白產生IPP的關鍵酶[91]。米曲霉蛋白酶水解產生含IPP和VPP的酪蛋白水解產物經臨床試驗證實具有良好的降血壓效果[92-93]。

8 關于乳三肽的專利

由于乳三肽具有明確的體內降血壓功效，目前已有大量關于它們新型生產方法的專利，其中最常見的是微生物發酵法。專利US2006/0246178[94]中報道了一種利用瑞士乳桿菌CNRZ 244（Lactobacillus helveticusCNRZ 244）發酵生產包含VPP和/或IPP乳制品的方法，原料可以使用含有酪蛋白的任意奶源，包括牛乳、羊乳、駱駝乳、馬乳、脫脂乳粉及重構乳；為了提高產品的適口性和風味，還可以在發酵過程中添加其他微生物例如釀酒酵母等。專利US6534304[95]篩選得到了一種具有高水解活性的瑞士乳桿菌CM4（Lactobacillus helveticusCM4）菌株，用其在37 ℃下對脫脂乳進行發酵，24 h后酸奶中的IPP和VPP質量濃度分別達到了23.5 μg/mL和38.5 μg/mL。專利US2011/0165135[96]使用3種新型的瑞士乳桿菌（CNCM I-3997、CNCM I-3998和CNCM I-3999）發酵牛奶，所得產品中IPP、VPP和LPP的質量濃度可以達到可爾必思產品（Ameal S?）的3 倍。專利US6890529[97]發現一種新的菌株瑞士乳桿菌LBK-16H（Lactobacillus helveticusLBK-16H）具有很高的蛋白質水解活性，將其在含9%牛奶的培養基中培養后，成功檢測到了VPP和IPP，兩者的質量濃度分別為6 mg/L和13 mg/L。

由于乳三肽富含Pro的特性，目前僅有少量專利利用酶解法來獲得乳三肽，且其中很多并未明確所使用的蛋白酶種類。專利WO2006/084560A1[98]公布了一種生產含IPP和VPP及VB的多肽水解物的方法：首先利用蛋白酶水解全脂牛奶、脫脂牛奶、酸性乳清、干酪乳清、酪蛋白、凝乳酶酪蛋白、動物蛋白明膠、骨頭、大豆、大米、玉米或小麥面筋等含有乳三肽序列的底物，然后對水解產物進行分離和濃縮，即可作為一種添加劑用于降血壓功能食品的制備。歐洲專利EP1231279[99]公開了一種酶解酪蛋白酸鹽制備含IPP和VPP水解物的方法，先用蛋白酶水解底物得到含有IPP和VPP序列的中間產物，然后再進一步酶解即得到IPP和VPP。專利US7879804[29]針對多酶復合水解耗時較長、工藝繁瑣、容易污染等問題，提出了單一水解步驟制備IPP和VPP的方法，利用脯氨酸特異性內切蛋白酶（proline specific endoprotease，PSE）并結合氨基肽酶對酪蛋白酸鹽在pH 4～6和40 ℃以上水解4 h后，IPP、LPP和VPP的含量分別達到了4.8、10.0 mg/g和5.0 mg/g。專利US8088597[100]則公開了一種利用PSE和氨肽酶結合水解糖巨肽生產低苦味、高IPP含量水解物的方法。

微生物發酵法和酶解法相結合也已被用于乳三肽的生產。專利US2011/0045130[30]先利用瑞士乳桿菌菌株100H（Lactobacillus helveticus100H）發酵脫脂乳，然后在發酵過程中添加Corolase LAP Ch.: 4123和PSE，所得水解產物中IPP、LPP和VPP的含量分別高達52.3、76.5 mg/g和79.6 mg/g。專利WO2009/065862[101]發現利用瑞士乳桿菌發酵脫脂牛奶僅能釋放出IPP和VPP，但是加入PSE和氨肽酶后，IPP、VPP、LPP均被釋放出來，且三者的含量分別為0.29、1.13 mg/g和0.26 mg/g。專利US2011/0142989[102]公開了一種利用來自曲霉的蛋白酶Umamizyme水解酪蛋白制備VPP、IPP和LPP的方法，發現結合瑞士乳桿菌CNRZ 244發酵可顯著提高水解產物中這3種三肽的含量。專利US2010/0151080[103]先使用木瓜蛋白酶F和菠蘿蛋白酶F水解脫脂乳，然后再使用瑞士乳桿菌CM4進行發酵，得到了IPP和VPP含量較高的酸奶制品。

表2對現有的關于乳三肽的專利進行了總結。

表2 目前關于乳三肽的專利Table 2 Summary of recent patents regarding lactotripeptides

9 IPP、VPP的天然新來源

牛奶中的酪蛋白是IPP、VPP和LPP的傳統來源，目前已經上市銷售的降血壓功能食品中的乳三肽均源自牛奶或酪蛋白，且多已申請國際專利保護。因此，開拓乳三肽的新來源對于新型降血壓功能食品的開發具有重要意義。隨著信息技術的快速發展，許多蛋白質的一級結構已經明確，這為尋找上述乳三肽的新來源提供了極大的便利。

9.1 奶類新來源

除了牛奶外，很多其他來源的奶中也含有酪蛋白，因此也是乳三肽的潛在來源。Tagliazucchi等對駱駝、山羊和綿羊奶進行體外消化，發現山羊和綿羊奶的水解物中含有VPP，駱駝、山羊和綿羊奶的水解物中含有IPP[76]，進一步研究表明體外消化可從山羊奶的β-和κ-酪蛋白中釋放出IPP和VPP[75]。另外，在水牛奶[108-109]和牦牛奶[110-111]及其制品的模擬胃消化液中也發現了含有IPP和/或VPP序列的一系列前體物質[108]。生物信息學分析表明，IPP還存在于馬奶和驢奶的κ-酪蛋白中[78]及駱駝奶的β-酪蛋白（片段173～175）和κ-酪蛋白（片段99～101）中[73]，VPP存在于駱駝奶的κ-酪蛋白中[73]。一項研究證實了上述發現，利用瑞士乳桿菌130B4（Lactobacillus helveticus130B4）發酵駱駝奶后，從水解產物中分離純化得到了含有IPP的九肽序列Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp[112-113]。

9.2 谷物新來源

使用Uniprot數據庫中的肽段檢索工具進行檢索，發現小麥、大米、黑麥、大麥、燕麥、玉米、小米等谷物的主要存儲蛋白中都含有IPP和VPP序列[78]。Hu Ying等的研究證實了上述結果，他們在小麥和黑麥的發酵酸面團中成功分離鑒定出了IPP和VPP[114]。因此，谷物蛋白也是乳三肽的新型來源。

表3對文獻報道的乳三肽的新來源進行了總結。

表3 乳三肽新來源的總結Table 3 Summary of the new sources of lactotripeptides

10 結 語

IPP、VPP和LPP對高血壓患者具有明確的預防和治療效果，而且安全性高，因此，是一類極具前景的生物活性物質，在第三代降血壓功能食品的研究與開發中具有廣闊的應用前景，國外已有多種產品上市。然而，目前乳三肽主要來源于酪蛋白，其生產工藝及產品開發已經較為成熟，但相關公司已對該來源的技術和產品進行了專利保護；乳三肽僅存在于特定的蛋白質中，而現有的生物信息學技術并未涵蓋所有蛋白質資源的序列，這限制了乳三肽新來源的開發；另外，乳三肽富含脯氨酸，而目前市面上商品化的蛋白酶很難直接水解蛋白質原料以獲得乳三肽?；谏鲜鲈?，雖然已有部分學者開始關注乳三肽，但是目前國內尚未發現相關產品上市。因此，尋找上述乳三肽的新來源以及開發新的生產工藝對于我國新型第三代降血壓功能食品的開發至關重要。