雜交水稻品種鑒定方法（綜述）

丁健美 劉之熙

摘 要 通過查閱文獻，歸納總結了目前用于雜交水稻品種鑒定的幾類方法。種子形態鑒定法、幼苗形態鑒定法、田間種植鑒定法、計算機模擬形態分析技術等形態學方法，難以辨別種子形狀差異和形態不太明細的真假品種，且鑒定周期長，在一定程度上受鑒定人員的自身技術與經驗制約。同工酶電泳鑒定、蛋白質電泳鑒定等生化鑒定法，受限條件較多，實際工作中應用較少。DNA分子技術鑒定法主要有RAPD標記鑒定、RFLP標記鑒定、AFLP標記鑒定、SSR標記鑒定、SNP標記鑒定。DNA分子標記鑒定，可應用于雜交水稻品種純度與真實性鑒定、審定監管等各環節，具有鑒定快速、周期短、準確、簡便、經濟等諸多優點，是農作物品種鑒定的發展方向。

關鍵詞 雜交水稻;品種鑒定

中圖分類號：S511.5 文獻標志碼：C DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.13.040

品種鑒定是種子市場監管和品種審定準入的主要內容，是育種工作的重要階段，也是衡量成果能否轉化的重要環節。因此，品種鑒定在種子生產、加工、儲藏及經營貿易等流通過程中具有重要意義和應用價值。但在種子流通中，為節省成本與縮短時間周期，往往忽略品種鑒定的重要性，導致仍有種子摻假的案件發生，給生產造成了難以挽回的損失[1]。雜交水稻是我國最主要的農作物，對保障國家糧食安全起到舉足輕重的作用，因此，隨著全國雜交水稻種植面積比重逐年增大，對雜交水稻種子的質量（主要是真實性和純度）檢查和監督尤為重要。目前，雜交水稻品種鑒定的方法主要有形態鑒定法、生化鑒定法、DNA分子技術鑒定法。

1? 形態鑒定法

1.1? 種子形態鑒定法

種子形狀比較穩定，故形態鑒定方法簡單，快速經濟。主要通過觀察種子的外觀形態特征，包括種子的長寬度與大小、形狀、顏色、光澤、種皮形態、堊白、胚乳等性狀，借助儀器或工具（如放大鏡、解剖鏡等）觀察，進行品種鑒定，一般情況下可鑒定出雜交水稻樣品的真實性[2-3]。但由于這些性狀只適用于品種間差異較大的樣品鑒定，且受鑒定者經驗的制約，品種鑒定結果可靠性較差，應用范圍較窄。

1.2? 幼苗形態鑒定法

在相同條件的溫濕度、光照等環境下，對種子進行培養，當發芽良好的種子生長發育到適合鑒定的幼苗階段，結合獨特的形態特征進行比較鑒定。李穩香等用幼苗形態鑒定法，發現應用于鑒定威優、汕優、協優系統的雜交一代均有較好效果，尤以鑒定威優46效果與田間種植鑒定結果均基本一致[4]。此鑒定方法較簡單，易于操作，成本低，鑒定周期短，鑒定結果較準確。但由于幼苗期所依據的性狀有限，且受種子處理方法與生長環境的影響頗大。因此，該鑒定方法只適用于幼苗形狀差異較明顯的品種。

1.3? 田間種植鑒定法

田間種植是鑒定品種最為可靠的方法之一，主要依據品種的特征特性進行鑒定。將種子適時催芽、播種，秧苗栽插到田間，通過水肥管理、病蟲害預防等，直到抽穗時進行鑒定。我國每年冬季都會在海南島進行田間種植鑒定，這種鑒定方法比較簡單，鑒定結果較為符合大批量的實際生產。雖然該鑒定方法不影響內地的農業生產，但鑒定時間較長，對于種子的經營特別是種子的出口貿易是一道不可逾越的障礙，尤其是我國加入WTO以后，這道障礙越來越明顯。受季節、環境等條件的影響，試驗有誤差（如光、溫敏兩系不育系），占用資源土地和生產技術人員，一旦試驗失敗，不容易重新布置試驗，但是不可否認的是，該鑒定方法適合大批量的實際生產。

1.4? 計算機模擬形態分析技術

在常規鑒定技術的基礎上利用計算機的優勢進行有限的模擬分析，在鑒定方法上并沒有根本改進，因而鑒定效果并不理想。

由于形態學方法難以辨別種子形狀差異和形態不太明細的真假品種，且鑒定周期長，在一定程度上受鑒定人員的自身技術與經驗制約。因此，通過專業的實驗室內檢測方法來代替形態學鑒定已成為雜交水稻種子鑒定技術發展的必然方向[5]。

2? 生化鑒定法

蛋白質是基因表達的產物，也是測定基因組一致性的依據。生化鑒定法的原理是依據不同品種之間所遺傳的物質不相同，則形成不一樣的RNA，最終產生不一樣的蛋白質或者同工酶。因此，生化鑒定法是在特定的環境下，利用電泳中的譜帶多樣性，對不同品種（系）的遺傳特性進行純度與真實性鑒定，具有不受外部環境影響、較為方便、鑒定準確性高等優點。此法主要包括同工酶電泳鑒定和蛋白質電泳鑒定。

2.1? 同工酶電泳鑒定

同工酶電泳技術于20世紀60年代初就初步應用于品種鑒定的研究。朱英國等對國內166個水稻品種在苗期進行酯酶同工酶檢測，獲得11種酶譜類型[6]。武漢大學遺傳研究所與北京種子公司協作，用水稻的幼苗為材料，并利用雜種F1和三系親本的酯酶同工酶圖譜的差異來鑒定不同的水稻品種和品系[7];顏啟傳也利用該技術檢測了雜交水稻及其三系親本的真實性和品種純度，通過檢測分析證實該鑒定法的檢測結果較準確，提高了鑒定分辨率[8]。因此，20世紀70年代已推廣同工酶電泳法用于品種鑒定，在生產上有著一定的應用價值和意義。

同工酶鑒定法對種子或幼苗的生長質量要求較高，酶的提取和電泳技術的實驗條件也要求嚴格，同工酶表達的特異性又影響著其在不同組織的分布與活性，一旦種子或幼苗出現長勢不太好，產生酶的活性低，就會直接導致酶帶模糊不清，影響鑒定結果，可利用的同工酶非常有限。

2.2? 蛋白質電泳鑒定

種子中蛋白質的種類及含量相對比較穩定，可以用作品種鑒定的依據。不同品種遺傳基礎物質的DNA不同，形成的模板RNA也有差異，使其合成的蛋白質表現出差異，依據品種之間在蛋白質的差異，利用電泳技術對品種的蛋白質進行分離檢查，制成電泳圖譜，通過觀察不同品種電泳圖譜的不同來加以區別。蛋白質電泳作為鑒定品種的一種方法，應用于雜交水稻品種鑒定方面的報道不多，陸作楣等提取62份雜交水稻三系親本和雜種一代種子胚乳貯藏蛋白中總蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白樣品，采用SDS-PAGE電泳法分析，根據谷蛋白譜帶特征的差異進行品種鑒定[9]。

蛋白質電泳鑒定法快速可靠，不受外部環境制約。但所用的提取液和電泳系統不同，萌芽的種子、幼芽或幼苗及成熟期各個時期表達不穩定，影響著電泳圖譜的分離，鑒定結果與操作過程也相關，如實驗材料的采集、電泳系統的條件、提取的蛋白液、膠濃度等不同，結果也會不同，導致難以形成統一標準[10-11]。此外，對于遺傳相近的品種之間，貯藏蛋白的標記多態性不太豐富，難以找到特異蛋白，在實踐中未得到推廣應用。

3? DNA分子技術鑒定法

隨著DNA分子技術鑒定應用于植物新品種鑒定大量研究的陸續開展，為雜交水稻品種鑒定提供了新的思路。DNA分子標記技術以其多態性高、遺傳穩定性強，在基因組中頻繁出現，易獲得、易操作、重復性好等特點被研究者廣泛關注和應用。研究表明，DNA分子標記可應用于雜交水稻品種純度與真實性鑒定，審定監管等各環節，其具備鑒定快速、周期短、準確及簡便、經濟等諸多優點[12-16]，是農作物品種鑒定的發展方向。

DNA分子技術鑒定不受生物體各組織、各發育階段、環境與季節的限制和人為因素的影響，同時，可以彌補和克服形態鑒定與生化鑒定的不足。目前，在雜交水稻分類中廣為應用的DNA分子技術鑒定主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SNP。

3.1? RAPD標記鑒定

RAPD是William JGK等和Welsh J等于1990年創建的一種分子標記，在PCR基礎之上的一種可對整個序列的基因組進行分析的分子技術。利用隨機引物對基因組DNA進行擴增得到多帶，而對某個特定的基因型來講，這些擴增的片段或片段的類型是唯一的，因此，可以用來鑒定品種。1996年，錢前等利用RAPD標記，成功實現對真、假“II優63”種子的鑒定[17]。相比RFLP，RAPD操作較簡單，所需的DNA量小，多態性強、操作簡便，成本較低。

隨著雜交水稻品種的豐富性及交易市場的活躍性，只用單個多態標記鑒定種子的做法，不能滿足特定品種大量篩選引物的需求，RAPD標記鑒定對引物的選擇和實驗的條件要求較嚴，因此，該技術在品種鑒定中有一定的局限性。

3.2? RFLP標記鑒定

RFLP即限制性片段長度多態性標記，是根據不同品種間不同基因組的限制性內切酶位點的堿基發生變化，或者是酶切位點間發生了堿基的缺失與插入，酶切位點的片段發生了變化，造成差異，這種差異可以通過特定的探針進行雜交檢測，根據探針位于染色體的不同位點可以作為一種分子標記，構建分子圖譜，根據圖譜的特異性，從而鑒別真假種子[18]。RFLP標記可用于形態標記、同工酶標記和蛋白質電泳技術難以區別的品種的鑒定。

RFLP是較早使用DNA分子標記的應用，檢查結果比較穩定，該技術已在小麥、玉米、黃瓜、辣椒、大白菜和甘藍等作物上得到初步應用。但RFLP對DNA的質量要求較高，檢測技術繁瑣，不適合雜交育種和品種鑒定的大規模應用。

3.3? AFLP標記鑒定

AFLP標記是以結合RFLP標記和PCR技術為基礎建立起來的，通過DNA制備、擴增酶切片段、凝膠及電泳四個基本步驟，對品種進行鑒定。陳一華等最少利用3對AFLP引物組合就可以區分l5個雜交水稻品種，根據品種間DNA多態性條帶的有無，轉換成1和0指紋數據，從而實現了計算機輔助種子鑒定[19]。美國先鋒公司培育的一個優良玉米雜交種的親本（申請專利）被一個小公司偷用制種，獲得了很大利潤。先鋒公司發現了該公司的侵權行為后，提出訴訟，但因證據不充分一直未能得到解決，最后，先鋒公司用AFLP技術獲得DNA指紋證據后贏得了訴訟，那個小種子公司因被罰巨額賠款而倒閉。

AFLP多態性水平相當高，且穩定可靠，但需DNA模板量大，需酶切，對DNA純度要求高，如基因組的酶切不完全，會影響鑒定結果。同時，操作程序長，步驟繁瑣，電泳技術較復雜，成本太高，并要求較高的試驗技能和高精度的儀器設備[20-21]，同時，它還是專利技術，難以在雜交水稻品種鑒定中普及使用。

3.4? SSR標記鑒定

目前在雜交水稻品種鑒定中，利用分子標記檢測技術最多的就是SSR分子標記鑒定，與RAPD、RFLP、AFLP分子標記鑒定法相比，SSR分子標記鑒定結果更容易觀察分析，且對差異不太明顯的品種也能鑒定區分。

SSR標記法是發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術，具有實驗穩定、多態性高、實驗程序簡單等優點，SSR標記法已被廣泛用于農作物類品種鑒定。SSR標記法主要包括DNA提取、PCR擴增、凝膠電泳、成像觀察四個基本步驟，檢測程序相對簡單，一份樣品從取樣、檢測及讀取結果可在幾小時內完成，且不受外部環境與季節的影響。

SSR標記兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列[22-23]。不同品種間微衛星基序重復次數的不同而形成了多態性，這種多態性可以通過PCR擴增檢測出來，即為簡單序列長度多態性[24]。優化PCR擴增程序主要是在保證取得較好擴增效果的前提下，縮短反應時間，提高工作效率。詹慶才利用SSR 標記鑒定雜交水稻種子純度時，改變PCR擴增程序，將變性和退火時間改為15 s，延伸時間改為30 s，擴增35個循環，縮短PCR反應時間，得到了理想的擴增結果[25]。

SSR標記法的DNA 提取和純化是雜交水稻品種鑒定重要而基礎的操作步驟。劉之熙等分別采用CTAB方法和簡單方法提取“兩優培九”幼苗的DNA，均以RM234為引物進行PCR擴增，結果表明簡單方法提取的DNA不會影響準確性和分辨率，且簡單方法縮短了提取時間，降低成本，極大地提高了工作效率;同時，對傳統CTAB和PCR程序進行了改善，利用4%的瓊脂糖凝膠進行電泳[26]。

隨著雜交水稻新品種組合的培育與栽培，SSR引物的特異性可能會逐步退化，甚至喪失，已有的SSR引物可能滿足不了新品種鑒定要求，因此，需不斷創建新的SSR標記。馬紅勃等利用12個SSR標記構建了42份雜交稻（其中有24份材料為雜交稻品種，另外18份材料為雜交稻親本）的DNA指紋圖譜，并對于遺傳多樣性進行統計分析[27]。通過聚類將這42個品種分成六大類群，較好地反映了品種之間的親緣關系，也為雜交親本的選擇提供了一定的參考。同時，所構建的指紋圖譜也為雜交水稻品種鑒定提供了科學依據。肖子發等通過實驗選用了48對SSR引物，多于國內一些專業檢測機構或科研單位采用的12對或24對引物[28];通過實驗，利用篩選的48對SSR引物完成了湖南省審定的77個雜交稻品種的DNA指紋圖譜構建，成功建立了品種指紋圖譜數據庫，可有效進行雜交水稻品種鑒定。

根據國家水稻品種鑒定DNA指紋方法推薦的24對SSR引物，任輝對8個雜交水稻品種進行SSR分子標記鑒定，優化DNA提取方法和PCR擴增反應體系，并將SSR分子標記鑒定結果與分別在5個不同省份的制種基地田間鑒定結果進行比較，統計分析發現：SSR分子標記鑒定結果與田間檢驗結果無顯著差異，但SSR分子標記鑒定結果更容易區分異（雜）種子，而田間鑒定結果難以區分相似的異（雜）株[29]。因此認為，采用SSR分子標記鑒定方法能夠更快速、更準確地鑒定雜交稻品種。

2014年6月1日，農業部出臺了新的農業行業標準（NY/T1433-2014）《水稻品種鑒定技術規程? SSR標記法》，當日正式實施，推薦引物增加48對，其中，保留了原來的19對引物，新增29對引物。曾曉珊等為確保研究結果與國家標準的一致性，采用國家規定的水稻品種真實性鑒定方法中要求的48對引物，對27個親本進行了DNA指紋分析，依次對27個水稻親本材料基因組DNA（按順序排列）進行PCR擴增，經顯影、拍照，得到一套SSR引物的圖譜[30]，根據所構建的指紋圖譜，可對某一品種的真實性進行鑒定。

綜上所述，通過SSR分子標記鑒定雜交水稻品種，其檢測技術已成熟。但隨著每年不斷出現新的品種，SSR引物的特異性可能喪失，因此，還需不斷優化和更新SSR分子標記鑒定體系。

3.5? SNP標記鑒定

SNP指在基因組上單個核苷酸的變異所形成的核酸序列多態性，是目前認為最具有研發潛力的檢測技術，與SSR標記相比具有以下優勢：1）遺傳穩定性更高;2）高效檢測、通量高，每次可檢測多個樣品，甚至上千個，實現數據統計分析自動化，共享發展數據平臺，間接降低了檢驗檢測成本;3）檢測快速，檢測位點數可達幾百萬個;4）部分標記與功能基因甚至植物表型相關。

美國康奈爾大學McCouch實驗室率先在Affymetrix公司定制了含有4.4萬個SNP標記的SNP芯片，國內研究者對幾千份國內外水稻品種的基因序列進行了重新測序，這些研究表明，通過SNP芯片構建水稻品種DNA指紋是切實可行的[31]。

王鈺等通過一種基于PCR的水稻SNP標記檢測方法結果得出，開發的SNP標記有助于分析水稻品種的遺傳差異[32]，也為建立水稻SSR/SNP指紋數據庫，實現水稻種子信息比對、追溯、防偽、統計、監管和服務等功能奠定了基礎。

2021年6月20日，全國農技中心在北京組織召開農業行業標準審定會，《水稻品種真實性鑒定? SNP標記法》《玉米品種真實性鑒? SNP標記法》《小麥品種真實性鑒定? SNP標記法》3項標準通過審定。標志著SNP標記法在生物檢測領域有著廣闊的發展前景，為維護農作物品種創新、市場流通秩序等提供了強有力的技術支撐及依據。

盡管SNP成本高、一般實驗室無法完成檢測分析工作，但SNP這項檢測技術具有準確性高的特點，能夠有效避免形態學和環境因素的干擾，從而極大地縮短育種進程。因此，構建全國統一標準的品種高密度SNP指紋十分必要，今后有望以加強SNP分型檢測儀等實驗室應用平臺為載體，融合種植鑒定，實驗室分子鑒定及分子育種協同發展，開啟雜交水稻品種鑒定的新篇章。

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收稿日期：2022-04-21

作者簡介：丁健美（1975—），女，湖南株洲人，本科，研究實習員，主要從事農業檢驗檢測。E-mail：djm1800@126.com。