實時熒光PCR方法檢測多種食源性致病菌的研究

姬莉莉

【摘要】目的：應用實時熒光PCR技術（real time PCR）聯合檢測小腸結腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結腸彎曲菌。方法：針對小腸結腸炎耶爾森菌foxA基因、霍亂弧菌ompW基因、腸出血性大腸桿菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌TLH基因、沙門氏菌ssaR基因、志賀氏菌ipaH基因、空腸彎曲菌hipo基因和結腸彎曲菌glyA基因，在其保守區域設計特異性引物和探針，檢測多種病原菌的特異性和靈敏度，并對臨床樣本和模擬樣本進行檢測，聯合鑒別多種食源性致病菌。結果：該方法特異性強，與單核細胞增生李斯特菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、輪狀病毒A組、輪狀病毒B組、輪狀病毒C組、諾如病毒G Ⅱ、札如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒核酸無交叉反應;靈敏度高，檢測陽性樣品均可達102 copies/mL;檢測30份臨床樣本和50份模擬樣本，準確性100%。結論：多種食源性致病菌實時熒光PCR檢測方法準確、可靠、操作簡單，今后可以大規模加速多種食源性致病菌的檢測。

【關鍵詞】實時熒光PCR ;食源性致病菌;核酸檢測;

【中圖分類號】R183【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）15-0178-04

食源性疾病是由于食用被病原體或其毒素污染的食物或水引起的一類疾病。引起食源性疾病的病原體通常被稱為食源性病原體，包括細菌，病毒，真菌和寄生蟲。自上世紀90年代起，食源性疾病的發病率顯著增加，已成為世界范圍內嚴重的公共衛生問題。根據世界衛生組織（WHO）的報告[1]，全世界每年有6億人因食用受污染的食物而患病，其中420萬人死亡。根據美國疾病預防控制中心（CDC）的報告，美國食源性疾病大約有4800萬例次，每年有12.8萬例住院治療，每年3000例死亡病例。近年來，中國也開始監測食源性疾病。2015年全國31個監測地區共上報食源性疾病暴發事件2401起，累計發病21374例，死亡139例[2]。食源性病原體的傳播來源于各種無任何處理的即食產品、生食或食用未煮熟的食品（如水果、蔬菜、海鮮、肉類和家禽）[3]。鑒于食源性疾病給全球公共衛生和經濟帶來的負擔，開發可靠、快速的病原體檢測方法至關重要。

傳統的基于培養的方法仍被視為病原菌鑒定的“金標準”，但該技術有幾個缺點，如檢測費時費力，難以定量分析，缺乏良好的靈敏度，不能同時檢測多種食源性病原體[4]。因此，需要一種快速、高度靈敏且價格低廉的檢測技術。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術是最常用的分子檢測方法之一。 PCR 技術可以通過檢測病原體特定的目標靶DNA 序列來檢測食物中存在的單一病原體。多重熒光 PCR 技術因其更低檢測限、閉管實時檢測和兼容多款檢測設備，已成為目前應用最廣的檢測技術。

本研究以小腸結腸炎耶爾森菌foxA基因、霍亂弧菌ompW基因、腸出血性大腸桿菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌TLH 基因、沙門氏菌ssaR基因、志賀氏菌ipaH基因、空腸彎曲菌hipo基因和結腸彎曲菌glyA基因作為目標基因，旨在建立一種可以同時檢測小腸結腸炎耶爾森、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結腸彎曲菌8種食源性致病菌的多重PCR 檢測方法，為食源性疾病爆發和食物中毒應急處置提供準確、可靠、操作簡單的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 菌株與DNA制備

小腸結腸炎耶爾森、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結腸彎曲菌樣品。菌株DNA 提取采用細菌核酸提取試劑盒，并按照操作說明書進行實驗操作。

1.2 儀器與試劑

SSNP-3000A 核酸提取儀（江蘇碩世生物科技股份有限公司），ABI 7500熒光定量 PCR 儀（美國Thermo Fisher 公司）。陽性對照質粒（上海捷瑞生物技術有限公司），SDK60108細菌核酸提取試劑盒（江蘇碩世生物科技股份有限公司），One Step ZZ 核酸擴增反應液（上海碩穎生物科技有限公司）。

1.3 引物的設計與合成

通過 NCBI 查找小腸結腸炎耶爾森菌foxA基因、霍亂弧菌ompW基因、腸出血性大腸桿菌O157 rfbE基因、副溶血弧菌 TLH 基因、沙門氏菌ssaR基因、志賀氏菌ipaH基因、空腸彎曲菌hipo基因和結腸彎曲菌glyA基因的基因組序列，通過 Primer Express3.0.1進行序列比對，采用BioEdit在選擇保守區設計特異性引物和探針。所用引物和探針均有上海碩穎生物科技有限公司合成。

1.4 實時熒光PCR反應

實時 PCR 反應體系如下：在25μL 反應體系中， One Step ZZ 核酸擴增反應液7.5μL、酶混合液5μL、引物探針反應液7.5μL、模板溶液5.0μL，滅菌雙蒸水補足體積至25μL。實時 PCR 反應條件如下：95℃預變性5 min;95℃變性10 s，55℃退火延伸30 s，經40個循環;55℃時熒光檢測，檢測通道選擇：FAM、VIC、 ROX、CY5。

1.5 特異性試驗

選擇與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體核酸，包括單核細胞增生李斯特菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、輪狀病毒 A 組、輪狀病毒 B 組、輪狀病毒 C 組、諾如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒共計13種病原體核酸，對熒光 PCR 方法進行特異性檢測。

1.6 靈敏度試驗

選取8種食源性致病菌質粒評價該方法的靈敏度。將標準質粒以10倍梯度稀釋成一系列標準品，選取101 copies/mL～105 copies/mL 共5個梯度進行 DNA 核酸提取后再進行熒光 PCR 檢測。每個濃度梯度稀釋液重復3份，每份進行20次重復檢測，具有90%以上陽性檢出率的濃度水平作為最低檢出限。

1.7 臨床樣本及模擬樣本檢測

本試驗共收集30例臨床樣本和50例模擬樣本，提取細菌DNA，用1.4部分所述得方法對樣品進行檢測，同時與常規培養進行比較，進一步確定該方法得可靠性。

1.8 統計學分析

所有檢測陽性結果和陰性結果數據均采用 Excel 進行統計分析，計算陽性檢出率。陽性檢出率（%）=陽性樣本檢出數（n）/待測樣本總數（N）×100%。

2 結果

2.1 特異性試驗結果

小腸結腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結腸彎曲菌均可檢測到相應的典型擴增曲線（圖1A 和 B），并且與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體包括單核細胞增生李斯特菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、輪狀病毒 A 組、輪狀病毒 B 組、輪狀病毒 C 組、諾如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒共計13種病原體核酸無交叉反應（圖1C），試驗結果顯示特異性良好，沒有出現非特異性擴增信號。

2.2 靈敏度試驗結果

試驗結果表明，稀釋度為102 copies/mL 的小腸結腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結腸彎曲菌陽性檢出率分別為92%、92%、97%、93%、90%、95%、93%、90%，陽性檢出率均大于90%，故小腸結腸炎耶爾森、霍亂弧菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和結腸彎曲菌靈敏度均可達102 copies/mL（表1）。

2.3 樣本檢測結果

采用本試驗所建立的方法對30例經過培養法鑒定的臨床樣本和50例使用陽性細菌制備的模擬樣本進行檢測，試驗結果表明，檢測到沙門氏菌10例，志賀氏菌10例，結腸彎曲菌10例，空腸彎曲菌10例，小腸結腸炎耶爾森菌10例，腸出血性大腸桿菌 O15710例，副溶血弧菌10例，霍亂弧菌10例，與常規確認方法檢測結果一致，準確性100%。

3 討論

在我國有研究報道2015年至2017年江西南昌食源性致病菌監測694份樣品中共檢測出食源性致病菌57株，陽性率達8.21%[5]。在2019年甘肅清水食源性爆發事件的研究報道，研究者對采集的986份食品中共檢出132株食源性致病菌，陽性率達13.39%[6]。食源性致病菌導致人類胃腸炎、敗血癥等疾病，其發病率不斷增加，嚴重威脅人們的生命健康，引發全球范圍內的重大公共衛生問題。食源性致病菌的快速準確檢測是預防疾病的重要手段，然而，常規微生物分離培養方法耗時且費力，因此高靈敏的快速檢測方法是非常必要的。目前，檢測技術已由培養水平向分子水平方向發展，尤其以高效特異性強、快速、低成本為優勢的分子生物學檢測技術為主，包括常規 PCR、多重 PCR、熒光實時 PCR 技術等[7]。PCR 技術是最常用的分子生物學檢測方法之一。PCR 技術早期已被廣泛應用于許多食源性致病菌如單核細胞增生李斯特菌，大腸桿菌O157∶H7，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲桿菌，沙門氏菌和志賀氏菌的檢測[8]。但單重PCR 技術檢測通量不高，已經逐漸被多重 PCR 技術和多重熒光 PCR 技術替代。多重 qPCR 檢測也開發用于多種食源性病原體的檢測和定量。楊國興等[9]采用多重 PCR 技術對肉制品標本中的金黃色葡萄球菌nuc基因、沙門氏菌SipB基因、志賀氏菌ipaH基因、單核細胞增生李斯特菌inlA基因4種常見食源性病原菌進行檢測。魏霜等[10]建立多重富集定量 PCR 針對collagenase、gyrB、ompW、vvhA同時檢測副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌和創傷弧菌。有研究者通過使用基于分子信標的多重 qPCR 檢測腸道沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌 O157、副溶血性弧菌、創傷弧菌、空腸彎曲桿菌、阪崎腸桿菌和志賀氏菌的靶基因（ssaR、hlyA、rfbE、toxR、vvh、gyrA、16SrRNA 和ipaH）[11]。多重熒光 PCR 技術因其更低檢測限、閉管實時檢測和兼容多款檢測設備，已成為目前應用最廣的檢測技術。

本研究采用的多重熒光 PCR 技術適用于待測樣本中多種靶基因核酸的定性檢測，即在一次 PCR 反應中使用雙管同步檢測小腸結腸炎耶爾森菌foxA基因、霍亂弧菌ompW基因、腸出血性大腸桿菌 O157 rfbE基因、副溶血弧菌 TLH 基因、沙門氏菌ssaR基因、志賀氏菌ipaH基因、空腸彎曲菌hipo基因和結腸彎曲菌glyA基因共8種食源性致病菌特異性基因。該方法特異性強，與常見腹瀉的其他病原體如單核細胞增生李斯特菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、輪狀病毒 A 組、輪狀病毒 B 組、輪狀病毒 C 組、諾如病毒 G Ⅱ、札如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒等無交叉反應。其靈敏度高，以具有90%以上陽性檢出率的濃度水平作為最低檢出限進行統計分析，本研究的食源性致病菌病原體的最低檢出限為102 copies/mL。楊夢婕等建立的GeXP多重 PCR 檢測技術對測大腸桿菌 O157∶ H7、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特菌和沙門氏菌6種常見食源性致病的最低檢測下限為103 CFU/mL[12]。張靜等報道多重高分辨熔解曲線技術結合熒光實時 PCR 同時檢測雞肉中的反應體系檢測中沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲菌的靈敏度均為102 copies/mL[13]。本研究建立的多重熒光 PCR 檢測方法對食源性致病菌的檢測靈敏度與此文獻報道相似。為進一步驗證該方法的準確性，本試驗對30例經過培養法鑒定的臨床樣本和50例使用陽性細菌制備的模擬樣本進行檢測，試驗結果表明該熒光 PCR 方法與常規確認方法檢測結果一致，準確性100%，表明該方法具有較好的檢測準確性。

本研究初步建立了小腸結腸炎耶爾森菌、結腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌 O157、副溶血弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌和霍亂弧菌8種食源性致病菌多重熒光 PCR 檢測方法，通過對本方法的特異性、靈敏度和準確性的分析評價，顯示該方法特異性強、檢測靈敏度較高，操作簡便，快速準確，具有適用于同步鑒別多病原靶標的優勢，適于推廣應用。

參考文獻

[1]? Oliver SP. Foodborne pathogens and disease special issueon the national and international PulseNet network[J]. Foodborne Pathog Dis，2019，16（7）：439-440.

[2] 付萍，王連森，陳江，等.2015年中國大陸食源性疾病暴發事件監測資料分析[J].中國食品衛生雜志，2019，31（1）：64-70.

[3]? Chung MS，Kim CM，Ha SD. Detection and enumerationof microorganisms in ready-to-eat foods，ready-to-cook foods and fresh-cut produce in Korea[J]. J Food Safety，2010，30（2）：480-489.

[4]? 劉占鰲，裴艷琴，葉華.多重熒光 PCR 快速檢測食源性致病菌的研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（24）：9308-9313.

[5]? 況強華，賴玉珍，裴小麗，等.2015-2017年南昌市食源性致病菌監測工作數據分析[J].醫學食療與健康，2018，16（6）：165.

[6] 趙慶壽.甘肅省清水縣食源性疾病監測情況調查研究[J].醫學食療與健康，2021，19（17）：197-198.

[7]? 鐘宜科，鄒大陽，趙彤，等.食源性致病菌核酸檢測技術研究進展[J].食品研究與開發，2020，041（012）：218-224.

[8] 侯進慧，蔡侃，樊繼強.食源性致病細菌檢測技術研究進展[J].食品工業科技，2012，33（7）：387-392.

[9] 楊國興，楊立新，李偉昊.多重 PCR 檢測4種常見食源性致病菌[J].食品安全質量檢測學報，2019，10（18）：6289-6295.

[10]? 魏霜，汪天杰，龍陽，等.多重富集定量 PCR （ ME-qPCR）同時檢測4種食源性病原弧菌[J].中國農業科學，2016，49（23）：4619-4627.

[11]? Hu Q，Lyu D，Shi X，et al. A modi?ed molecular beacons-based multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of eight foodborne pathogens in a single reaction and its application[J]. Foodborne Pathog Dis，2014，11（3）：207-214.

[12] 楊夢婕，徐玲麗，馬學軍，等.肉及肉制品中6種致病菌的GeXP多重 PCR 檢測[J].食品研究與開發，2021，42（13）：168-173.

[13]? 張靜，周倩，唐夢君，等.高分辨熔解曲線技術結合熒光實時 PCR 法同時檢測雞肉中4種食源性致病菌[J].現代食品科技，2021，37（6）：296-303.

（收稿日期：2022-01-29）