布魯氏桿菌及檢測方法研究進展

包小雅 楊宇昊 翟景波

摘要：布魯氏桿菌是一種胞內寄生菌，現階段針對布魯氏桿菌病主要從細菌學、血清學、分子生物學等幾方面進行檢測。該文對布魯氏桿菌及檢測方法加以介紹，以期為后續研究提供參考。

關鍵詞：布魯氏桿菌;血清學檢測;分子生物學檢測

中圖分類號：R516.7文獻標識碼：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.001

Research Progress in Brucella and Detection Methods

BAO Xiaoya1，YANG Yuhao2，ZHAI Jingbo1

（Medical School，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028000，China;2.College of Animal Science and Technology，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028000，China）

Abstract：Brucellosis is mainly detected from bacteriology，serology，molecular biology and so on. In this paper，Brucella and its detection methods are introduced in order to provide reference for the follow-up research.

Keywords：brucella，serological detection，molecular biological detection

0引言

布魯氏桿菌病（Brucellosis）簡稱布病，是一種由布魯氏桿菌引起的人畜共患型傳染病。1887年，英國醫生Bruce于一病死于“馬耳他熱”的患者脾臟內分離到了布魯氏桿菌，自此該病原菌被公布于世。該病流傳范圍極其廣泛，于170多個國家和地區均有流傳[1]。世界動物衛生組織（OIE）將布病設為必須通報的動物疫病，我國也將該病列為二類動物疫病。

1病原學

布魯氏桿菌為革蘭氏陰性菌，屬α-變形菌，菌體多呈現球桿狀，也可見卵圓狀，大小為（0.5～0.7）μm×（0.6～1.2）μm，無運動性、無天然質粒，除部分具有毒力的菌株外多數菌株同樣不具有莢膜，為兼性胞內寄生。與其他胞內寄生菌相區別的是，該菌不含陰性菌所有的外毒素等毒力因子，且不具有抗原變異性，這些特性可幫助其脫逃免疫防線成功侵入機體內并進行復制。在入侵過程中，布魯氏桿菌的非經典脂多糖（lipopolysaccharide，簡稱LPS）可與細胞表面特異性受體進行相互作用，保護菌體不受殺菌肽及補體引發的裂解，從而協助菌體逃避免疫應答，此外該結構在菌體發揮毒性的過程中也起著十分重要的作用[2]。

布魯氏桿菌可感染多數的哺乳動物及部分兩棲動物，目前已知的主要有6種經典類型19個亞型，分別為B.melitensis（羊種，主要感染綿羊和山羊，分為1、2、3亞型）、B.abortus（牛種，分為1、2、3、4、5、6、7、9亞型）、B.suis（豬種，主要感染豬、野兔、野豬、馴鹿和嚙齒動物，分為1、2、3、4、5亞型）、B. canis（犬種）、B. neotomae（沙林鼠種）、B.ovis（綿羊附睪種）。之后又鑒定到B.microti（田鼠型）、B.pinnipediae（鰭型）、B.cetacea（鯨型）、B.vulpis（狐貍型）和B.inopinata（人類為天然宿主）5種類型菌種。此外，還有從兩棲類動物中分離出布魯氏桿菌的報道[1]。目前，我國已經分離到該菌的6個經典種及其所有亞型。

2檢測方法

2.1細菌學

細菌學檢測是布病檢測的“金標準”，該檢測方法可根據布魯氏桿菌在無二氧化碳環境下、含堿性品紅染劑或不同設置的生化培養基內的生長狀態進行細菌的基因分型[3]，在疾病的診斷與流行病學調查上具有重要意義。動物布病檢測可選擇流產胎兒、陰道分泌物、奶水、血液等組織為樣本進行培養。該方法準確性高，但所需時間較長，且布魯氏桿菌的培養鑒定需在生物安全3級以上的實驗室進行操作，分離過程危險性較高，因此不適用于疫情緊急檢測[4]。

2.2血清學

由于血清學檢測相對簡單、成本低、陰性預測值高，在經濟和技術資源有限的流行地區，血清學檢測仍是主要的診斷工具。目前針對布病已經開發了高效的血清學檢測技術，多見于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、補體結合試驗、凝集試驗、熒光偏振檢測方法和膠體金免疫層析技術。

2.2.1酶聯免疫吸附試驗

將菌體抗原包被于ELISA板上，若被檢血清內含有相應抗體，此時板內則會形成抗原抗體復合物，之后加入酶標二抗，再與酶的底物進行反應產生顏色，最后根據酶標儀檢測樣品的OD值得出抗體量。該項檢測技術準確性高，但操作需要專業技術人員及儀器，因此不適用于基層大規模檢測。補體結合試驗是通過將布魯氏桿菌補體結合抗原與待檢血清中的抗體結合形成復合物，復合物再與補體結合，從而不再引起指示系統中紅細胞溶血的檢測方法[5]。該方法敏感性強，特異性高，是OIE認可的血清學檢測的標準檢測法，多應用于牛羊布病的檢測。

2.2.2凝集試驗

布病常用的凝集試驗為虎紅平板凝集試驗（RBPT）與試管凝集試驗（SAT）。虎紅平板凝集是根據虎紅平板抗原對IgG類抗體進行檢測，操作簡單、快速，適用于大范圍的布病篩查工作[6]。試管凝集試驗則是針對IgM抗體進行檢測，不易受非特異性抗體的干擾，假陰性率低，可對疾病進行定性分析[7]。此外，2- 巰基乙醇試驗（2-ME）和乳牛全乳環狀試驗（MRT）也被應用于布病的檢測。

2.2.3熒光偏振檢測

最早的熒光偏振檢測技術是由Nielsen等建立的，主要利用分子旋轉特性，來測量抗原與抗體的結合進行檢測，但由于檢測設備價格昂貴，目前市場上尚未廣泛應用該方法進行布病的檢測[8]。

2.2.4膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術是將膠體金標記技術、免疫檢測技術和蛋白層析技術相結合的以硝酸纖維膜作為載體的固相膜免疫分析技術，該技術檢測快速，可被廣泛應用于現場的快速檢測，在臨床上具有廣闊的應用前景和極大的發展潛力[9]。

2.3分子生物學

近些年，分子生物學診斷不斷取得進展，特別是針對一些培養難度較大的微生物所引起的感染。由于布魯氏桿菌屬的培養條件具有一定特殊性，因此分子生物學檢測是其最優的檢驗方式。布病的分子生物學檢測方式以聚合酶鏈式反應、實時熒光定量PCR、重組酶聚合酶擴增以及環介導等溫擴增等4種方法較為多見。

2.3.1聚合酶鏈式反應（PCR）

近年，PCR檢測技術憑借其操作方法簡單、準確率高等優勢再檢測領域占有一定優勢。Paul[10]等針對不同基因片段設計了5對引物，建立了可檢測布魯氏桿菌分型的多重PCR方法，之后對80株布魯氏桿菌進行鑒別檢測，成功地區分出了不同種屬的菌株。Morata等[11]為評估PCR檢測法對布魯氏桿菌的診斷率，對比了34份不同樣品下PCR與常規微生物培養技術的準確率，結果顯示PCR準確率為97%，靈敏度遠高于培養所得的29.4%。

2.3.2實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是許多實驗室診斷的首選方法。該技術將聚合酶鏈反應與熒光報告分子的使用相結合，以便在PCR反應的每個周期中監測擴增產物。良好的靈敏度和特異性、可重復的數據、低污染風險和減少人工操作時間的相結合，使得實時PCR技術成為傳統PCR的一種替代方法。為對該方法靈敏度進行檢測，研究者使用SYBR Green I熒光定量PCR對10例布魯氏桿菌陽性樣本進行檢測，并與傳統的微生物學技術進行了比較。結果顯示Wright的血清凝集30%呈陰性，而SYBR Green I熒光定量PCR檢測陽性為90%。表明了該檢測方法具有良好的敏感度[12]。

2.3.3重組酶聚合酶擴增

重組酶聚合酶擴增（RPA）是一種核酸體外擴增技術，與傳統PCR技術不同，該方法在核酸復制過程中形成D型結構，之后雙向引物同時復制，從而實現基因片段的指數型增長。且復制的整個過程只需在37～42 ℃的恒溫條件下進行即可。Ren等[13]建立了一種用于檢測布魯氏桿菌的重組酶聚合酶擴增方法（RPA），該檢測方法可在20 mm內檢測到每個反應中至少有3拷貝布魯氏桿菌。RPA具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優勢。

2.3.4環介導等溫擴增

與RPA相似，環介導等溫擴增（LAMP）同樣是是一種快速、簡便的DNA檢測方法，不同的是該檢測方法所需溫度為60 ℃。Bhat等[14]應用不同引物及試劑的LAMP進行RT-LAMP檢測，并與qPCR結果進行比較。試驗結果顯示RT-LAMP分析的靈敏度比qPCR高10倍左右。且該檢測方法與其他病原菌沒有任何交叉反應，其特異性強，是直接和早期檢測布魯氏桿菌的一種特異和快速診斷工具。

3討論與結論

布病病程較長，為慢性傳染性疾病，臨床表現不具有特異性，多見于波浪熱、關節性疾病以及生殖系統疾病，且嚴重程度依據個體不同臨床差異性較大，這為疾病的治療增加了極大的難度。動物患病后的臨床表現不明顯，可見于流產及生殖系統疾病，多數患畜無明顯臨床表現。

對于布病而言，防控與及時的診斷極為重要，各種診斷手段都存在不同的利弊，必要時需要結合多種檢測手法進行共同診斷。日常的防控工作中要注意動物疫苗的注射，現階段主要應用的疫苗為弱毒苗，基因工程苗也在研究中[15]。

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