ε-聚賴氨酸對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300的作用機制

劉萌 魏蓮花 林賦桂 李可可 劉東霞 楊雅迪 廖蓓 關曉雯

摘要：目的 研究ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）標準菌株USA300的抑菌作用及其機制。方法 依據CLSI微量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration， MBC）；繪制24 h內不同濃度ε-PL作用后USA300菌株時間-抑菌曲線；SYBR Green I/PI檢測ε-PL處理后USA300的生存情況；測定ε-PL處理后菌液電導率、胞外ATP含量、可溶性蛋白含量的變化；利用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察ε-PL對USA300形態的影響。結果 ε-PL對USA300的MIC、MBC分別為5.12和10.24 mg/mL。ε-PL處理后細菌死/活比例，菌液電導率，胞外ATP含量，胞外可溶性蛋白含量均增加，表明菌膜破損；經SEM進一步確證。結論 ε-PL對USA300生長有良好的抑制作用，且與ε-PL濃度呈正相關。ε-PL處理后細胞膜結構破壞、通透性改變，導致細胞內容物大量滲出，其抑菌機制可能與破壞細菌菌體結構有關。

關鍵詞：ε-聚賴氨酸；USA300； 抑菌機制

中國分類號：R978.1文獻標志碼：A

Antibacterial effect and mechanism of ε-polylysine against methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA300

Liu Meng1， Wei Lian-hua2， Lin Fu-gui2， Li Ke-ke2， Liu Dong-xia3， Yang Ya-di3， Liao Bei3， and Guan Xiao-wen4

（1 NingXia Medical University， Yinchuan 750004; 2 Department of Clinical Laboratory， Gansu Provincial Hospital， Lanzhou 730000;

3 Lanzhou University， Lanzhou 730000; 4 Gansu University of Traditional Chinese Medical， Lanzhou 730000）

Abstract Objective To investigate the antibacterial activity and mechanism of ε-polylysine （ε-PL） against methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） standard strain USA300. Methods Microbroth dilution was performed to determine the minimal inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） of ε-PL according to the CLSI document. The time-inhibition curve of USA300 strain was evaluated after the treatment with ε-PL at different concentrations within 24 h. SYBR Green I/PI was used to detect bacterial survival after ε-PL treatment. The changes of electrical conductivity， extracellular ATP content and soluble protein content were determined after ε-PL treatment. The effect of ε-PL on the morphology of USA300 was observed by scanning electron microscopy （SEM）. Results The MIC and MBC of ε-PL to USA300 were 5.12 and 10.24 mg/mL， respectively. The ratio of dead to alive， electric conductivity， extracellular ATP content and extracellular soluble protein content increased after ε-PL treatment，which indicated the rupture of USA300 and further confirmed by SEM. Conclusion ε-PL has a significant inhibitory effect on the growth of USA300， which was positively correlated with the drug concentration. After treatment of ε-PL， the structure of cell membrane was destroyed and the permeability of cell membrane was changed， resulting in a large amount of exudation of cell contents. Its antibacterial mechanism may be related to the destruction of bacterial cell structure.

Key words ε-polylysine; USA300; Antibacterial mechanism

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S. aureus）是人類和動物化膿感染中最常見的病原菌之一，可引起局部化膿感染，也可引起敗血癥和膿毒血癥等全身感染[1]。作為“ESKAPE”生物之一，S. aureus在世界范圍內引發了越來越大的威脅，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是金黃色葡萄球菌引起的主要感染類型之一[2-3]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的出現限制了抗生素的使用，給病原菌的清除和防治帶來巨大的困難和挑戰。近年來，國內外學者致力于從天然抗菌肽中尋找抗菌藥物，研究表明，多種天然抗菌肽具有良好的抗菌活性。如ε-聚賴氨酸（ε-PL），ε-PL是一種天然的廣譜抗菌陽離子多肽，最早從白色鏈霉菌的發酵液中發現，由25～35個賴氨酸殘基通過α-簇基和ε-氨基脫水縮合形成酰胺鍵連接而成，分子量通常為2.5～4.5 kDa[4]。2003年，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration， FDA）將其批準為新型天然食品防腐劑，作為安全多肽在食品中使用[5]。ε-PL憑借抗菌譜廣、耐熱、耐酸堿等優點，對于革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌等具有良好的抑菌效果[6-8]，但ε-PL對MRSA的抑制作用及機制尚無基礎實驗驗證。本研究以USA300（MRSA標準菌株）為試驗菌株，探究ε-PL對其的抑菌作用及機制。

1 材料

1.1 菌株

USA300菌株由復旦大學仁濟醫院李敏教授惠贈。

1.2 主要試劑

ε-聚賴氨酸（鄭州拜納佛生物工程股份有限公司），胰蛋白胨大豆培養基、ATP含量檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、SYBR Green I核酸染料（10000×）、PBS緩沖液、碘化丙啶（PI）均購自索萊寶，氯化鉀（KCl）、二甲亞砜、無水乙醇均購自國藥集團化學試劑有限公司，鹽酸萬古霉素、苯唑西林鈉、氯仿/三氯甲烷均購自麥克林，2.5%戊二醛（Servicebio）。

1.3 主要儀器設備

酶標分析儀RT-6500（深圳雷杜生命科學股份有限公司），紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），倒置熒光顯微鏡（Olympus），Scientz-IID超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司），立式全溫振蕩培養箱（上海旻泉儀器有限公司），離心機（Eppendrof），便攜式電導率儀（青島路博偉業環保科技有限公司），壓力蒸汽滅菌器（山東博科生物產業有限公司），離子濺射儀MC1000（日本Hitachi公司），掃描電鏡SU8100（日本Hitachi公司），高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），BSC-1004 ll A2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

2 方法

2.1 菌株保存及復蘇

接種環挑取-80℃冰箱中保存的USA300菌株，接種在TSA固體培養基上，37℃，恒溫培養箱培養過夜。挑取單個菌落接種于新鮮的TSB液體培養基中，37℃，180 r/min，培養16 h到穩定期，再次轉接于新鮮培養基，37℃，180 r/min，活化3 h培養至對數期，將菌液與滅菌后50%（體積分數）的甘油1：1比例混合后，分裝保存在-80℃冰箱中。復蘇時將凍存的菌液解凍后以1‰（體積分數）接種于TSB培養基中，37℃，180 r/min，培養16 h，備用。

2.2 MIC和MBC的測定[9]

依據CLSI文件[10]微量肉湯稀釋法測定MIC，將復蘇后菌液，1‰接種于新鮮培養基，37℃，180 r/min震蕩培養至對數期，使用TSB培養基將活化后的菌液稀釋至5×106? CFU/mL。在TSB肉湯中制備ε-PL溶液，通過連續倍比稀釋獲得不同的亞抑菌濃度（0.32～163.84） mg/mL。96孔板每孔中加入菌懸液和ε-PL稀釋液孔各100 μL，同時設置生長對照孔（不加ε-PL處理）和空白對照孔（培養基200 μL）。37℃下培養24 h，黑色背景下肉眼觀察未見菌落生長的最小藥物濃度即為MIC。將MIC實驗中MIC不同孔培養混合物涂布在血瓊脂平板上，37℃培養24 h后生長菌落數≤5個的最小藥物濃度即為MBC[11]。

2.3 ε-PL對USA300生長的影響[12]

將2.1所制備的USA300菌懸液按照2.2的方法處理樣本，將不同濃度的ε-PL加入菌懸液中，37℃，180 r/min震蕩培養24 h，每隔2 h吸取100 μL液體，加入96孔板中測定其600 nm處的吸光度值并繪制時間-抑菌曲線。每組試驗平行重復3次。

2.4 SYBR Green I /PI檢測ε-PL作用后不同時間USA300菌株的生存率

按照“2.2”方法處理樣本。各取上述菌液1 mL于編號為1～4的無菌EP管中，分別加入ε-PL（終質量濃度為MBC）、萬古霉素（終質量濃度為Cmax=25 μg/mL）[13]、苯唑西林（終質量濃度為Cmax=63 μg/mL）[13]、等量無菌水，2～4號分別為陽性對照、陰性對照、空白對照。37℃，180 r/min震蕩培養7 d。分別在3、5和7 d從相應的EP管中吸取100 μL，5000 r/min，離心5 min，棄上清液。PBS（pH 7.4）洗滌2次，等體積PBS重懸混勻。金黃色葡萄球菌的染色染料是通過SYBR Green I與PI （1：3）在100 μL蒸餾水中混合制成的[14]。將SYBR Green I/ PI 染色混合物（10 μL）添加到每100 μL的每個樣品中。將樣品渦旋混勻，室溫條件，黑暗孵育30 min。載玻片上滴加6～7 μL樣品，熒光顯微鏡下觀察并隨機選取視野拍攝圖像。

2.5 電導率測定[15]

按照2.2的方法處理樣本。將稀釋的細菌懸液分成5個燒瓶，向每個燒瓶中加入不同濃度的ε-PL：1/4 MIC、1/2 MIC 、1×MIC、2×MIC，設置空白對照組（不加ε-PL處理）。37℃振蕩培養24 h，每隔4 h分別吸取5 mL培養液，5000 r/min 離心10 min，取上清液并用電導率儀（測定前經KCI校準）測定其電導率。 每組試驗平行重復3次。

2.6 胞外ATP測定[16]

按照“2.2”的方法處理樣本。將稀釋的細菌懸液分成3個試管，分別加入不同濃度的ε-PL：0、1×MIC、2×MIC，分別在4、8和16 h取樣。實驗具體操作按照ATP含量檢測試劑盒說明書所述步驟進行。每組試驗平行重復3次。

2.7 胞外可溶性蛋白含量測定[17]

按照“2.2”方法處理樣本。將稀釋的細菌懸液分成3個試管，分別加入不同濃度的ε-PL：0、1×MIC、2×MIC。分別在4、8和16 h取樣，5000 r/min離心10 min，PBS洗滌3次并重懸，將重懸后的菌體進行低溫超聲破碎（功率200 W，超聲2 s，停1 s，3 min）后，5000 r/min離心10 min，取上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）說明書介紹的實驗步驟測定樣品的蛋白濃度，根據蛋白濃度標準曲線及加樣體積計算其含量。

2.8 掃描電鏡觀察ε-PL處理對USA300形態結構的影響[18]

按照“2.2”方法處理樣本。3000 r/min，離心10 min，用PBS（pH 7.4）洗滌3次，棄上清液，加入ε-PL（終質量濃度為10.24 mg/mL），設置空白對照組（未加ε-PL處理）。37℃處理12 h，以5000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，除凈上清液，4℃條件下使用2.5%戊二醛固定12 h。2500 r/min離心4 min，0.1 mol/LPBS清洗10 min，此步驟重復3次。依次使用50%、60%、70%、80%、90%和100%濃度的乙醇對細胞進行脫水，最后用叔丁醇替代乙醇。將樣品固定、風干，于離子濺射儀中噴金。掃描電鏡觀察并隨機選取視野拍照。

2.9 數據處理

所有試驗均平行重復3次，實驗數據用IBM SPSS Statistics 26軟件進行統計學分析，當P＜0.05時具有統計學意義，使用GrandPad Prism軟件進行繪圖。

3 結果與分析

3.1 最小抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）

由表1可知，ε-PL對USA300的MIC為5.12 mg/mL。

從肉眼可見清晰的微孔中移取菌懸液的涂布結果（表2）可知，ε-PL對USA300的MBC為10.24 mg/mL。

3.2 ε-PL對USA300對生長的影響

由圖1知，空白對照組細菌生長呈典型的“S”型生長，1/4 MIC ε-PL（P<0.05）、1/2 MIC ε-PL（P<0.001）、MIC ε-PL（P<0.0001）組細菌A值增長的幅度較空白對照組明顯減少，2×MIC ε-PL組細菌的吸光度值幾乎沒有變化（P<0.0001）。

3.3 SYBR Green I /PI檢測 ε-PL作用后不同時間USA300菌株的生存率

SYBR Green I /PI檢測可以評估各種細菌病原體的生存能力。SYBR Green I是一種滲透性染料，可將所有活細胞染成綠色，而PI是一種非滲透性染料，僅將死亡或細胞膜受損的細胞染成紅色[14]。因此，易于通過熒光顯微鏡的綠色/紅色熒光比率代表細菌種群的生存能力。由圖2可知，對照組（圖2A、圖2E、圖2I）USA300菌體細胞完全存活；陽性對照組（圖2B、圖2F和圖2J）隨培養時間的延長，USA300的生存率逐漸下降，培養至第5天時（圖2F），鏡下紅色熒光比率增加，大部分菌體死亡，部分菌體裂解，培養至第7天時（圖2J），鏡下紅色熒光少數可見，幾乎全部菌體裂解、死亡；陰性對照組初期（圖2C）對USA300有一部分殺菌作用，培養至第5天以后（圖2G和圖2K）幾乎完全耐藥，USA300菌體細胞基本存活；ε-PL處理后（圖2D、圖2H和圖2L）USA300的生存率隨處理時間的延長生存率逐漸下降。

3.4 ε-PL對USA300菌液電導率的影響

由圖3結果可知，藥物濃度為MIC和2×MIC組的電導率相對于對照組，有顯著性差異（P <0.05）。

3.5 ε-PL對USA300胞外ATP的影響

由圖4知，ε-PL處理初期，對照組和細菌組的ATP含量無明顯差別（P>0.05），當藥物作用8 h之后，與對照組相比，藥物組胞外可溶性蛋白含量增加（P<0.05）。

3.6 ε-PL對USA300胞外可溶性蛋白含量的影響

根據蛋白濃度標準曲線（y=1.8091x＋0.0558，R2=0.9906）以及加樣量，計算得出各時間點對照組與1×MIC及2×MIC藥物組USA300可溶性蛋白的含量，見表3和圖5。當藥物作用8 h之后，與對照組相比，藥物組胞外可溶性蛋白含量有顯著性差異（P<0.05）。

3.7 ε-PL對USA300菌體細胞形態的影響

掃描電鏡可以對經ε-PL處理后的USA300菌體細胞進行更直觀的形態觀察。由圖可知，空白對照組（圖6A）USA300菌體細胞表面光滑、形態飽滿且呈典型葡萄狀緊密排列、大小均一，細胞膜完整，無表面損傷。實驗組（圖6B）菌體形態結構遭到破壞，菌體皺縮變形，表面粗糙。由此可見，ε-PL可以破壞USA300菌體形態結構。

4 討論

近年來研究報道的抗菌藥物，對其作用機理的研究多集中在藥物對菌體細胞結構及代謝過程的影響上。包括破壞細胞壁的結構、改變細菌細胞膜的通透性、影響能量代謝、干擾蛋白質合成的表達及核酸合成過程等。MRSA除對甲氧西林耐藥外，對其他所有與甲氧西林相同結構的β-內酰胺類和頭孢類抗生素均耐藥，MRSA還可通過改變抗生素作用靶位，產生修飾酶，降低膜通透性等不同機制[19]。

ε-PL具有較高的親水性、無毒性和可降解等特點，且具有廣泛抗菌活性。前期研究結果表明，ε-PL對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，因此推測其對MRSA也可能有一定抑菌效果[20-21]。本研究首先通過微量肉湯稀釋法測定了USA300的MIC值，ε-PL濃度為5.12 mg/mL時，黑色背景下，肉眼可見菌懸液清晰，而2.56 mg/mL ε-PL菌液渾濁，有細菌生長；試驗結果表明5.12 mg/mL ε-PL可以抑制USA300的生長。菌懸液涂布法試驗結果發現10.24 mg/mL ε-PL對USA300有一定的殺菌抑制作用，因此可以確定其MIC和MBC值分別為5.12和10.24 mg/mL 。為進一步分析ε-PL對USA300的抑菌活性，繪制了不同濃度下ε-PL的生長曲線，由生長曲線得出不同濃度的ε-PL對USA 300的生長表現出不同程度的抑制作用，即呈濃度依賴性。空白對照組細菌生長呈典型的“S”型生長，說明細菌生長狀況良好。2×MIC ε-PL組細菌其A600值幾乎沒有變化，表示ε-PL完全抑制了USA300的生長。因此，從研究結果可以得出ε-PL可以有效減慢甚至完全抑制USA300的生長的結論。此外，SYBR Green I /PI檢測試驗表明ε-PL對USA300的生存率有影響，對其菌體細胞有部分殺傷作用，但作用效果弱于萬古霉素處理效果。

細菌質膜為小離子如Na+和K+等的通過提供了滲透性屏障，電解質滲漏，電導率增加，表明滲透屏障的破壞。此外，維持離子穩態是維持能量狀態、溶質轉運、代謝調節、控制細胞運動等的組成部分，即使膜結構相對較小的變化也會有害地影響細胞代謝并導致細菌死亡[22]。不同濃度的ε-PL處理后對細菌細胞膜的完整性有不同程度的影響，隨著處理時間的延長和ε-PL濃度的增加，菌懸液的電導率不斷增加，說明細菌細胞膜的通透性會相應增加，導致電解質的滲漏，從而導致細胞死亡。

蛋白質是有機體生命活動的物質基礎，本研究通過檢測USA300可溶性蛋白含量的變化，發現ε-PL可以抑制USA300可溶性蛋白的表達，蛋白質作為生命活動的主要承擔者，其合成量的降低對菌體細胞的生理生化功能將產生嚴重的影響。這些結果表明ε-PL能夠對細胞質膜造成不可逆的損傷，并通過破壞細胞膜而降低細胞可溶性蛋白的含量，蛋白質是微生物細胞的大分子，是微生物細胞的關鍵結構成分，在暴露于大氣中后，蛋白質從微生物細胞中釋放出來。由于細胞質膜的不可逆損傷，蛋白質從處理過的細菌中迅速損失，從而導致菌體細胞死亡。同時，葡萄糖作為金黃色葡萄球菌最常見的能量代謝底物，在無氧條件下，經糖酵解過程釋放少量ATP。ATP的代謝水平間接反映了有機體生命活動的狀態。當細菌在遭受到藥物作用時，通常會使其生物膜破損或流動性降低，從而導致細胞內容物溢出。ε-PL處理初期，推測可能是細菌本身對藥物有一定的適應期，因此細菌本身細胞壁和細胞膜的組成和結構特性等對藥物表現出一定的耐受性；ε-PL作用8 h以后，藥物組（1×MIC及2×MIC）ATP胞外含量增加，說明ε-PL可以改變細胞膜的通透性，從而增加胞外ATP含量，證實了其對USA300細胞膜的破壞作用。經掃描電鏡觀察，進一步驗證了ε-PL對USA300的作用。

綜上所述，ε-PL對USA300抑菌機制可能與破壞細菌菌體結構有關，其他抑菌機制還需要進一步研究。

參 考 文 獻

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