氟康唑氯化鈉注射液的質(zhì)量評價

周茜 劉晨曦 吳蔚 龐璋帆 汪楊 趙亞萍

摘要：目的 對國產(chǎn)氟康唑氯化鈉注射液的質(zhì)量狀況進行評價。方法 采用法定標(biāo)準檢驗結(jié)合探索性研究，對檢驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 按法定標(biāo)準檢驗158批樣品，合格率為100%。探索性研究采用文獻報道的有關(guān)物質(zhì)測定方法，對樣品進行檢測，合格率為95.4%；采用LC/MS對主要雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)確認，并進行來源分析；氟康唑氧化降解雜質(zhì)為主要雜質(zhì)，部分企業(yè)的原料和制劑中存在未知的弱極性雜質(zhì)，優(yōu)化后的有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)可對其同步控制。結(jié)論 國產(chǎn)氟康唑氯化鈉注射液的整體質(zhì)量較好，各企業(yè)產(chǎn)品存在不同程度的質(zhì)量差異。原料工藝控制水平是影響本品質(zhì)量的關(guān)鍵因素，相關(guān)企業(yè)應(yīng)對原料進行優(yōu)選并提高生產(chǎn)工藝控制水平。現(xiàn)行標(biāo)準無法有效控制弱極性雜質(zhì)，pH值及滲透壓摩爾濃度的限度范圍有待規(guī)范，標(biāo)準亟待修訂。

關(guān)鍵詞：氟康唑氯化鈉注射液；有關(guān)物質(zhì)；質(zhì)量評價

中圖分類號：R978.1文獻標(biāo)志碼：A

Quality assessment of fluconazole and sodium chloride injection

Zhou Qian1，2， Liu Chen-xi1，2， Wu Wei1，2， Pang zhang-fan1，2，Wang Yang1，2， and Zhao Ya-ping1，2

（1 Hubei Institute for Food and Drug Control， Wuhan 430075; 2 Hubei Engineering Research Center for Drug Quality Control， Wuhan 430075）

Abstract Objective To evaluate the quality of fluconazole and sodium chloride injection. Methods? ? ?The statutory standard tests combined with exploratory researches were used to evaluate the quality by statistical analysis of the results. Results According to the statutory standards for the examination of the 158 batches of samples， the qualified rate was 100%. Analysis methods of related substances were developed， and the qualified rate was 95.4% according to the exploratory researches standards. The structures and sources of impurities were confirmed by using LC/MS; fluconazole oxidative degradation impurity was the major impurity. Some unknown nonpolar impurities existed in fluconazole raw materials and preparations， which can be detected and controlled by this method. Conclusion The overall quality of fluconazole and sodium chloride injection was good， but differences in the level of impurities， the pH value， and osmolarity was found between generic products and innovative drugs. The quality of raw materials was the key to the quality of products， the domestic enterprises should optimize the raw materials and production processes to improve the product quality; the current statutory standards should be unified and further improved.

Key words Fluconazole and sodium chloride injection; Related substance; Quality evaluation

氟康唑1980年由Pfizer制藥研發(fā)，1988年在英國和法國獲準上市，1991年列為世界衛(wèi)生組織（WHO）抗真菌基本藥物，1992年國內(nèi)開始生產(chǎn)并用于臨床[1]。氟康唑?qū)倏拐婢幹猩贁?shù)的水溶性藥物之一，常用于真菌性疾病特別是白色念珠菌、新型隱球菌等深部真菌性疾病的治療[2]。不良反應(yīng)的發(fā)生率為10%～16%，主要為消化道反應(yīng)、過敏反應(yīng)、肝毒性反應(yīng)、血細胞變化、神經(jīng)系統(tǒng)等方面。劑型有片劑（含分散片）、膠囊劑、顆粒劑、滴眼液、注射用凍干制劑和注射劑（注射液和注射用濃溶液）；本次國家藥品評價性抽驗僅針對氟康唑氯化鈉注射液一種劑型。

國內(nèi)氟康唑氯化鈉注射液的處方基本一致，個別廠家在處方中添加EDTA作為金屬螯合劑。部分企業(yè)采取先溶解氯化鈉，加活性炭，過濾后，濾液中加氟康唑，后用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值的生產(chǎn)工藝；部分企業(yè)采用同時加入氟康唑和氯化鈉，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，再加入活性炭的工藝。

本次國評共抽取158批樣品，涉及生產(chǎn)企業(yè)22家（所占比例為21.1%），涉及批準文號22個（所占比例為19.5%）。所涉及的規(guī)格為3種，分別為50 mL： 0.1 g、100 mL： 0.2 g和200 mL： 0.4 g（所占比例為75%）。本文依據(jù)現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準，在完成法定檢驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)法定檢驗所發(fā)現(xiàn)的問題及品種劑型特點進行相應(yīng)的探索性研究，對國產(chǎn)氟康唑氯化鈉注射液的質(zhì)量狀況進行客觀評價并提出建議。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Thermo LTQ XL液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛公司）；天大天發(fā)GWJ-5微粒分析儀（中國天大天發(fā)儀器公司）；XS205電子天平（美國Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

醋酸鈉（分析純），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純），購自默克股份有限公司，甲醇（色譜純），購自美國默克股份有限公司；超純水由Millipore純水儀制備。氟康唑?qū)φ掌罚ㄅ?00543-201602，含量99.9%）購自中國食品藥品檢定研究院；來自全國22家制劑生產(chǎn)企業(yè)的158批次氟康唑氯化鈉注射液。

2 試驗方法

2.1 法定檢驗

本次國評執(zhí)行標(biāo)準為中國藥典2015版和注冊標(biāo)準YBH00232016；原研地產(chǎn)化制劑執(zhí)行進口注冊標(biāo)準JX20130312。

2.2 探索性研究

針對法定檢驗中發(fā)現(xiàn)的問題，結(jié)合品種特點及調(diào)研情況等，重點開展有關(guān)物質(zhì)方法優(yōu)化、雜質(zhì)譜分析、滲透壓、包材相容性及穩(wěn)定性等項目的探索性研究。

2.2.1 有關(guān)物質(zhì)方法優(yōu)化

參考相關(guān)文獻[3]擬定了有關(guān)物質(zhì)測定方法，可有效分離在此次國評中涉及的所有氟康唑已知雜質(zhì)。色譜條件如下：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：醋酸鈉緩沖液（0.01 mol/L，pH 5.0）-甲醇（95：5， V/V）；流動相B：乙腈-甲醇（60：40， V/V），按表1線性梯度洗脫。檢測波長為261 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為40℃；進樣體積100 μL。

2.2.2 雜質(zhì)譜研究

LC/MS測定采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以醋酸銨緩沖液（0.01 mol/L，甲酸調(diào)節(jié)pH為5.0）-甲醇（95：5）作為流動相A，乙腈-甲醇（60：40）作為流動相B，按表1進行梯度洗脫；柱溫為40℃；流速為1.0 mL/min；進樣體積100 μL；柱后分流，0.3 mL/min進質(zhì)譜檢測器。一級質(zhì)譜掃描范圍（m/z）：100～900；二級質(zhì)譜掃描范圍（m/z）：50～900。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：采用正離子模式采集；毛細管溫度350℃，鞘氣流量：5.2 L/min，輔助氣流量：3 L/min，毛細管電壓：24 V；多級質(zhì)譜碰撞電壓：25～40 eV；其中9.5～10.5 min的洗脫液不進質(zhì)譜分析以降低主成分峰的污染。

2.2.3 包材相容性研究

本次抽樣產(chǎn)品使用了4種包裝材料即三層共擠輸液用袋、聚丙烯輸液瓶、鈉鈣玻璃輸液瓶、中硼硅玻璃輸液瓶，為了解不同包裝材料對本品質(zhì)量的影響，對這4種包裝材料的產(chǎn)品通過加速試驗考察材料中所含金屬元素、抗氧劑、塑化劑、硫化劑、多環(huán)芳烴類、亞硝胺類等有害物質(zhì)是否遷移到藥品中。將10批玻璃+鹵化丁基膠塞的樣品倒置加速1個月，通過考察不溶性微粒的變化，探索膠塞對氟康唑氯化鈉注射液不溶性微粒的影響。

2.2.4 滲透壓摩爾濃度[4]

按照中國藥典2015版四部滲透壓摩爾濃度測定法（通則0632）的要求，對本次抽驗20個廠家54批次的樣品進行考察。

2.2.5 無菌保障水平[5]

對企業(yè)開展問卷調(diào)研，根據(jù)企業(yè)反饋的資料，結(jié)合該品種的抑菌屬性，按照中國藥典2015年版四部無菌檢查法（通則1101）的要求，開展了無菌檢查方法學(xué)驗證。

3 試驗結(jié)果

3.1 法定標(biāo)準檢驗的結(jié)果

本次抽驗涉及的各標(biāo)準在檢驗項目設(shè)置、檢驗方法和限度范圍等方面的規(guī)定不盡相同，按各自現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準檢驗，158批樣品全部合格，合格率為100%；但發(fā)現(xiàn)法定質(zhì)量標(biāo)準存在如下問題：①有關(guān)物質(zhì)色譜條件對氟康唑極性大的雜質(zhì)分離效果不佳，對極性小的雜質(zhì)洗脫能力不強，中國藥典只對雜質(zhì)總量有要求，未對單個已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)進行限定；②缺滲透壓摩爾濃度檢查；③在各論下未指定無菌檢查的沖洗量和陽性對照菌，容易出現(xiàn)假陰性。

3.2 探索性研究結(jié)果

根據(jù)法定標(biāo)準檢驗中存在的問題和制劑本身的劑型特點，本文主要開展了優(yōu)化有關(guān)物質(zhì)條件，雜質(zhì)譜分析、基因毒性雜質(zhì)檢測、穩(wěn)定性研究、滲透壓考察、包材相容性等方面研究。

3.2.1 優(yōu)化有關(guān)物質(zhì)條件

按優(yōu)化的有關(guān)物質(zhì)方法對60批制劑樣品進行檢測，檢驗各企業(yè)樣品，總雜介于0.08%～0.58%，均值為0.29%，雜質(zhì)數(shù)為7～28個（圖1）。其中原研地產(chǎn)化樣品（企業(yè)22）雜質(zhì)個數(shù)為7～9個，雜質(zhì)總量為0.37%～0.42%，高于本次抽檢國內(nèi)產(chǎn)品平均水平；國內(nèi)企業(yè)20和企業(yè)21使用同一家企業(yè)的原料，但企業(yè)20的雜質(zhì)總量顯著性高于企業(yè)21，經(jīng)過對比企業(yè)20和其提供的相應(yīng)廠家（原料廠家C）的原料，制劑雜質(zhì)總量和原料一致，雜質(zhì)主要為原料帶入，提示原料廠家C的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性有待提高。企業(yè)19的7批樣品中，4批軟袋包裝的樣品中均檢出1個未知雜質(zhì)，雜質(zhì)量達到0.17%（圖2），而3批玻璃包裝的樣品未檢出該雜質(zhì)（圖3），由于不同包裝為不同生產(chǎn)線，已建議該企業(yè)進行自查。其他企業(yè)雜質(zhì)控制較好且無明顯差異（圖4～5）。新建方法的分離效能優(yōu)于現(xiàn)行方法，還能將更多的弱極性雜質(zhì)洗脫出來，更能更真實地反映樣品雜質(zhì)情況，結(jié)果按現(xiàn)行標(biāo)準限度再次評價，合格率為95.4%。

經(jīng)比對，制劑的雜質(zhì)水平與原料藥的雜質(zhì)情況顯著相關(guān)。本次抽樣涉及的制劑生產(chǎn)企業(yè)，其原料源自4家企業(yè)。原料企業(yè)A和企業(yè)B合成路線相同，以環(huán)氧氟康唑為起始物料，1H-1，2，4-三氮唑的烷基化得到氟康唑；上述兩家企業(yè)的原料雜質(zhì)個數(shù)為5～6個，雜質(zhì)總量為0.10%～0.35%。原料企業(yè)C和企業(yè)D合成路線較長，以間二氟苯為起始原料，Corey-Chaykovsky反應(yīng)，得到環(huán)氧氟康唑，再次1H-1，2，4-三氮唑的烷基化得到氟康唑；采用該路線得到的原料，雜質(zhì)個數(shù)在10個以上，雜質(zhì)總量為0.5%～1.0%。其中，企業(yè)D生產(chǎn)的4批次原料不同批號的原料，批號為191002和批號為190402的最大未知雜質(zhì)（保留時間為85.2 min）（圖1）均超過0.5%；批號為181102和200101兩批次在該位置雜質(zhì)檢出量僅為0.01%和0.003%（表2）；該企業(yè)的工藝穩(wěn)定性值得改進。

3.2.2 雜質(zhì)譜分析

本品中存在共計28個雜質(zhì)，其中眾多未知雜質(zhì)含量均低于0.01%，屬于微量雜質(zhì)。采用LC/MS共推斷出9個主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并對其來源進行歸屬，各雜質(zhì)依次編號為1～9（表3）：雜質(zhì)1和3為工藝雜質(zhì)；降解雜質(zhì)中的雜質(zhì)3為EP中收載的雜質(zhì)A，該雜質(zhì)是反映原料工藝、樣品儲存情況的指針性雜質(zhì)，其含量在總雜中的占比為30%～80%，也是各企業(yè)產(chǎn)品中的共有雜質(zhì)。原研地產(chǎn)化樣品檢出最大雜質(zhì)為雜質(zhì)3，檢出量分布在0.25%～0.33%，在總雜中的占比超過75%，以此推斷原研產(chǎn)品使用的原料其合成路線與本次收集的合成路線不相同。

3.2.3 雜質(zhì)基因毒性確證及測定

對于含有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)8，按照ICH M7的指導(dǎo)原則，采用國際上認可度高的雜質(zhì)毒性預(yù)測軟件Sarah軟件，進行基因毒性預(yù)測；結(jié)果分類3，表示該雜質(zhì)有警示結(jié)構(gòu)，與原料藥結(jié)構(gòu)無關(guān)，且目前沒有誘變性數(shù)據(jù)。由于該雜質(zhì)為國內(nèi)氟康唑原料合成的起始物料或產(chǎn)生的中間體，所以確證其是否有基因毒性有很重要的意義。

采用Ames試驗進行確證，結(jié)果顯示，在有或無代謝活化條件時，其中單次操作中TA1535菌株的5000 μg/皿與陰性對照組相比具有3倍或以上的顯著上調(diào)，環(huán)氧氟康唑Ames試驗結(jié)果判斷為陽性。基于毒理學(xué)關(guān)注閾（TTC）計算該雜質(zhì)的可接受攝入量，雜質(zhì)8的限度應(yīng)為12.5 ppm。

在此濃度下，HPLC-UV檢測器的靈敏度已無法滿足檢測的需求。開發(fā)了液相-三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用的定量方法進行測定，該方法定量限（LOQ）和檢出限（LOD）為2.5 ppm和1 ppm，可用于氟康唑雜質(zhì)8的測定。經(jīng)檢測，國產(chǎn)氟康唑原料和制劑中均未檢出雜質(zhì)8，企業(yè)合成時對該物質(zhì)的控制水平較好，因此標(biāo)準中無需額外控制。

3.2.4 包材相容性

各企業(yè)的產(chǎn)品經(jīng)過倒置加速后，包裝材料為玻瓶加膠塞的產(chǎn)品發(fā)現(xiàn)有不同程度的Si遷移，其他的多環(huán)芳烴、亞硝胺、增塑劑、硫化劑和抗氧劑均未檢出。且玻瓶加膠塞的樣品中小粒徑的不溶性微粒有顯著增加，不同企業(yè)的增加幅度有較大差別（圖6）。

3.2.5 滲透壓摩爾濃度考察

22家企業(yè)的樣品檢測滲透壓摩爾濃度結(jié)果分布在280～295 mOsmol/kg，均在等滲范圍內(nèi)（圖7）。

3.2.6 無菌方法的驗證

在過濾量為600 mg/膜和1000 mg/膜的情況下，與菌液對照管進行比較，在沖洗500 mL/膜時，所有驗證用試驗菌在供試品管、菌液對照管中均生長良好，說明沖洗500 mL/膜可消除該供試品的抑菌作用，其無菌檢查法可依據(jù)中國藥典2015年版四部通則1101無菌檢查法薄膜過濾法進行檢驗，沖洗量為不少于500 mL/膜，以白色念珠菌為陽性對照菌。

4 結(jié)論

本次抽檢結(jié)果顯示，氟康唑氯化鈉注射液的整體質(zhì)量較好，法定檢驗的合格率為100%。有關(guān)物質(zhì)分析提示氟康唑氯化鈉注射液的雜質(zhì)基本由原料帶入，且原料中存在較多的弱極性未知雜質(zhì)，所以控制原料的質(zhì)量至關(guān)重要。原料企業(yè)D的質(zhì)量穩(wěn)定性較差，4批次的樣品不合格率為50%，企業(yè)應(yīng)該認真分析原因，以防再次出現(xiàn)不合格樣品。制劑生產(chǎn)過程中，有廠家在軟袋包裝的產(chǎn)品出現(xiàn)特定未知雜質(zhì)，建議企業(yè)認真追溯是否出現(xiàn)包材與藥品不相容的問題。玻璃瓶+膠塞的樣品中均測出有Si元素，應(yīng)為膠塞上硅油的遷移；不同廠家的膠塞和藥液接觸不同程度上增加了樣品中不溶性微粒風(fēng)險，建議廠家應(yīng)重視所使用膠塞的質(zhì)量。此外，國產(chǎn)樣品pH值分布在4.3～5.9之間，平均值為5.3；地產(chǎn)化樣品pH值分布在6.1～6.4之間，平均值為6.2；地產(chǎn)化樣品的pH值更趨于中性。本次評價結(jié)果提示相關(guān)企業(yè)應(yīng)進一步加強生產(chǎn)工藝控制水平或優(yōu)選原料來源，建議生產(chǎn)單位積極開展一致性評價工作，優(yōu)化處方工藝，提升產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量。

質(zhì)量標(biāo)準存在的問題：目前各質(zhì)量標(biāo)準存在有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準測定方法不統(tǒng)一，控制的雜質(zhì)種類及限度寬泛，檢測方法靈敏度不夠等問題；而國外藥典中，美國藥典USP采用多個色譜條件對氟康唑注射液（大容量和小針統(tǒng)一命名）的極性雜質(zhì)和非極性雜質(zhì)進行分別控制。建議對本品的標(biāo)準進行統(tǒng)一提高。

氟康唑氯化鈉注射液為臨床治療真菌感染一線用藥，應(yīng)用廣泛，國內(nèi)生產(chǎn)廠家超過100家，但從未有對國內(nèi)臨床實際使用產(chǎn)品的整體質(zhì)量進行評價。本項目首次依據(jù)從全國各省市不同環(huán)節(jié)抽取到的158批次樣品，開展標(biāo)準檢驗和探索性研究，對全國氟康唑氯化鈉注射液總體質(zhì)量水平以及質(zhì)量標(biāo)準進行評價，對企業(yè)研發(fā)和生產(chǎn)水平提高有重要指導(dǎo)意義。

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