大腦前額皮層Nrg1基因敲低對小鼠精神分裂癥樣行為形成的影響

叢啟杰,曾榮森,劉耘溪,孫競

(江蘇大學藥學院,江蘇 鎮江 212013)

精神分裂癥是一種以思維與行為不協調為主要特征的重度精神類疾病,其發生與神經發育相關基因突變密切相關[1]。神經調節素1(neuregulin 1, Nrg1)是精神分裂癥易感基因,在調控神經元樹突發育、軸突髓鞘形成等神經活動中發揮重要作用[2-3]。值得注意的是,不同腦區基因表達變化與精神分裂癥的發生發展密切相關[4],其中前額皮層是興奮性谷氨酸神經系統投射以及大腦思維活動控制的重要區域[5]。研究發現,地卓西平誘導的神經發育精神分裂癥小鼠模型中NRG1蛋白表達下降；奧氮平、利培酮和氟哌啶醇能夠上調NRG1表達并發揮抗精神分裂癥行為異常的作用[6]。郭文平等[7]研究通過雙環己酮草酰二腙誘導的發育障礙精神分裂癥小鼠模型發現,前額皮層Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達降低,推測Nrg1基因可能參與少突膠質細胞的脫髓鞘和髓鞘再生。研究表明,前額皮層與其他腦區的功能性連接障礙[8]、神經遞質紊亂[9]及精神分裂癥的異常行為存在關聯,但前額皮層Nrg1基因突變對小鼠精神分裂癥行為異常的影響尚不清楚。因此,本研究通過腦立體定位注射技術構建前額皮層Nrg1基因敲低C57BL/6小鼠,對其神經行為表型進行鑒定,以研究大腦前額皮層Nrg1基因敲低在C57BL/6小鼠精神分裂癥樣行為表型形成中的作用,并初步探究其導致精神分裂癥表型的相關分子信號機制。

1 材料與方法

1.1 siRNA來源、主要試劑及儀器

陰性對照siRNA(產品編號:siN0000004-4-10)購自廣州銳博生物技術有限公司；Nrg1-siRNA(靶標序列:GTCTAGGACATAGTGAGTA)委托廣州銳博生物技術有限公司合成,通過2′甲氧基及5′膽固醇修飾siRNA,聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化siRNA,干粉狀態于-20 ℃保存。

PBS、Trizol裂解液、NanoDropTM8000分光光度計、逆轉錄試劑盒均為美國Thermo公司產品；熒光定量試劑盒(德國Roche公司)；IP細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白上樣緩沖液均購自碧云天試劑公司；蛋白質常規分子標志物、小鼠抗小鼠β-肌動蛋白單克隆抗體、兔抗小鼠NRG1單克隆抗體、兔抗小鼠囊泡型γ-氨基丁酸轉運體(vesicular GABA transporter,VGAT)多克隆抗體、羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗均購自武漢三鷹公司；小鼠抗小鼠囊泡型谷氨酸轉運體-1(vesicular glutamate transporter 1, VGLUT1)單克隆抗體(英國Abcam公司)；腦立體定位儀(廣州瑞沃德公司)；曠場實驗箱、高架十字迷宮均為上海然哲儀器設備公司產品；Noldus EthoVision XT軟件(北京諾達思公司)；LightCycler?96 System(德國Roche公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像分析系統(上海勤翔科學儀器公司)。

1.2 動物模型建立

1.2.1 動物及分組 8周齡SPF級成年雄性C57BL/6小鼠45只,體質量22～25 g,購自江蘇大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(蘇)2018-0012。基于曠場實驗將小鼠分為3組:正常對照組,陰性對照組和Nrg1-siRNA組,每組15只。

1.2.2 腦立體定位注射 采用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉小鼠,剪去頭頂部毛發,固定于腦立體定位儀。頭頂部正中切口,暴露前囟和后囟,調整固定器使前囟和后囟在同一水平面上。采用顱骨標志定位,注射位點為矢狀縫左側1.5 mm,前囟前1.5 mm,顱骨平面向下1.5 mm處,另一側位與矢狀縫對稱。正常對照組兩側前額皮層注射2 μL PBS,陰性對照組和Nrg1-siRNA組小鼠兩側前額皮層分別注射2 μL 0.25 mmol/L陰性對照siRNA和Nrg1-siRNA,每側注射10 min,結束后滯留時間5 min。取出注射器,縫合皮膚,將小鼠放置于保溫環境中適應,觀察小鼠狀態,4 d后進行后續實驗。

1.3 前脈沖抑制實驗

小鼠放入背景噪音為65 dB的檢測箱中適應5 min,每15 s通過偽隨機試驗進行前脈沖抑制測試,測試包括6次驚嚇脈沖(120 dB,40 ms/次),144次混合類型脈沖,接著6次驚嚇脈沖后結束,共計156次測試。混合類型脈沖包括:背景噪音(65 dB,80 ms/次),單獨驚嚇脈沖(120 dB,40 ms/次),5種單獨前脈沖(分別為69、73、77、81、85 dB,20 ms/次),5種單獨前脈沖與驚嚇脈沖聯合(140 ms/次)。前脈沖抑制率(%)=(1-前脈沖與驚嚇脈沖聯合刺激反應幅度/單獨驚嚇脈沖反應幅度)×100%。在每次測試之間,用75%乙醇徹底清洗檢測箱,以消除嗅覺提示再進行下一組實驗。

1.4 曠場實驗檢測小鼠自發運動

通過在曠場實驗箱中監測小鼠的活動來評估小鼠的自發活動。將小鼠放置在設備的中央,自由記錄30 min。箱體上方裝備行動軌跡采集攝像機,Noldus EthoVision XT軟件分析處理運動軌跡和參數。分析運動軌跡和總步行距離判斷各組自發運動變化情況。在每次測試之間,用75%乙醇徹底清洗實驗箱,以消除嗅覺提示。

1.5 高架十字迷宮實驗檢測小鼠焦慮狀態

高架十字迷宮是非條件反射模型,以動物自發的恐懼反應為行為學基礎。該設備由懸空的十字架型臂組成,包含一組開放臂和一組封閉臂。將小鼠頭部朝向非開放臂放置在四個臂的中央區域,自由記錄5 min。箱體上方裝備行動軌跡采集攝像機,通過Noldus EthoVision XT軟件分析處理運動軌跡和參數。記錄動物進入開放臂時間百分比和次數百分比。在每次測試之間,用75%乙醇徹底清洗實驗箱,以消除嗅覺提示。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測Nrg1 mRNA表達

取前額皮層區域注射部位腦組織50～70 mg,采用Trizol法提取總RNA。使用NanoDropTM8000分光光度計檢測總RNA含量和純度。逆轉錄體系包括總RNA模板5 μg,Oligo(dT)18引物1 μL,加無RNA酶水至12 μL,65 ℃加熱5 min。加入反應緩沖液4 μL,RNA酶抑制劑1 μL,10 mmol/L dNTP混合液2 μL和RevertAid RT 1 μL,短暫離心后42 ℃加熱60 min,70 ℃加熱5 min。繼而取cDNA 2 μL,SYBR Green Master 10 μL,正向和反向引物各0.2 μL,無RNA酶水加至20 μL體系,行實時熒光定量PCR檢測。95 ℃ 預熱10 min；95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40個循環；72 ℃ 5 s,95℃ 1 s；程序:37 ℃ 冷卻30 s。以β-肌動蛋白為內參基因,采用2-ΔΔCt方法計算結果。β-肌動蛋白:正向引物5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,反向引物5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′；Nrg1:正向引物5′-TTCCCATTCTGGCTTGTCTAGT-3′,反向引物5′-CCAGGGTCAAGGTGGGTAG-3′。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測NRG1、VGAT和VGLUT1蛋白表達

取注射部位前額皮層區域腦組織,低溫勻漿后冰上裂解30 min；4 ℃行14 000×g離心15 min,取上清液。BCA法測定蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液制備蛋白樣品,100 ℃煮沸5 min變性處理。經12.5% SDS-PAGE分離蛋白；80 V分離20 min,110 V分離70 min；300 mA轉膜90 min至PVDF膜；將膜置于封閉液中室溫封閉1 h；TBST洗膜3次,每次15 min；將膜置于一抗稀釋液中(NRG1、VGAT和VGLUT1,稀釋比均為1 ∶1 000,β-肌動蛋白稀釋比為1 ∶2 000,稀釋液為TBST),4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次,每次15 min；將膜置于二抗稀釋液中(羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗稀釋比均為1 ∶1 000,稀釋液為TBST),室溫孵育1 h；TBST洗膜3次,每次15 min；ECL超敏發光液曝光,化學發光成像系統成像拍照,Image J軟件用于灰度分析。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 Nrg1-siRNA注射降低前額皮層Nrg1 mRNA和NRG1蛋白表達量

注射后4 d,每組隨機抽取5只小鼠檢測前額皮層Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達量。結果顯示,Nrg1-siRNA組小鼠前額皮層注射腦區Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達量均顯著低于正常對照組(t=9.860、5.770,P均<0.01)。與正常對照組相比,陰性對照組Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達差異無統計學意義(t=1.069、1.436,P均>0.05)。由此表明,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠模型構建成功。見圖1。

a: P<0.01,與正常對照組比較

2.2 前額皮層Nrg1基因敲低小鼠前脈沖抑制受損

前脈沖抑制實驗結果顯示,在前脈沖預刺激為69 dB、73 dB、77 dB、81 dB和85 dB時,Nrg1-siRNA組小鼠的前脈沖抑制率均顯著低于正常對照組(t=3.481、3.296、3.755、3.489、3.498,P均<0.05)；正常對照組與陰性對照組相比,差異無統計學意義(P均>0.05)。由此表明,Nrg1基因敲低小鼠前脈沖抑制受損。見圖2。

a: P<0.05,與正常對照組比較

2.3 前額皮層Nrg1基因敲低小鼠自發活動量增加

曠場實驗結果顯示,與正常對照組相比,Nrg1-siRNA組小鼠移動總距離顯著增長(t=6.874,P<0.01),平均速度也顯著升高(t=4.607,P<0.01),表明小鼠的自發活動量增加。此外,Nrg1-siRNA組小鼠在中心滯留的時間顯著低于正常對照組(t=5.805,P<0.01),提示小鼠可能出現了焦慮行為。見圖3。

a: P<0.01,與正常對照組比較

2.4 前額皮層Nrg1基因敲低小鼠表現出焦慮行為

高架迷宮實驗結果顯示,Nrg1-siRNA組小鼠進入開放臂的次數百分比和時間百分比顯著低于正常對照組(t=6.501、6.466,P均<0.01),正常對照組與陰性對照組相比,差異無統計學意義(P均>0.05)。由此說明Nrg1基因敲低小鼠出現了焦慮樣行為異常。見圖4。

a: P<0.01,與正常對照組比較

2.5 前額皮層Nrg1基因敲低對VGAT和VGLUT1蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡結果表明,與正常對照組相比,Nrg1-siRNA組小鼠前額皮層VGAT蛋白表達水平未發生顯著變化,VGLUT1/VGAT比值明顯增加(t=10.180,P<0.01)。正常對照組與陰性對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

a: P<0.01,與正常對照組比較

3 討論

siRNA作為轉染質粒,可直接用于在體動物轉染,與以病毒為載體的shRNA相比,具有毒性低、安全性高等特點。本研究采用腦立體定位注射Nrg1-siRNA構建前額皮層Nrg1基因敲低小鼠,結果顯示,Nrg1-siRNA組小鼠大腦前額皮層Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達量均顯著降低,表明Nrg1基因敲低小鼠模型構建成功。陰性對照組小鼠大腦前額皮層Nrg1mRNA和NRG1蛋白表達量變化差異無統計學意義,驗證了Nrg1-siRNA的特異性,不存在非特異性敲低現象,進一步證實Nrg1基因敲低模型的可靠性。目前研究認為,精神分裂癥癥狀主要分為陽性癥狀、陰性癥狀和認知功能障礙[10]。精神分裂癥患者感覺門控功能損傷是導致以前脈沖抑制率降低和言行不一致為表現的陽性癥狀的主要原因之一[11]。Hong等[12]研究提出,Nrg1基因rs3924999的錯義突變可能與精神分裂癥患者前脈沖抑制功能的減弱有關。本研究顯示,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠的前脈沖抑制率顯著降低,初步驗證了以上結論。另一方面,自發活動量增加被認為是與精神分裂癥陽性癥狀密切相關的異常行為[13]。本研究曠場實驗結果顯示,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠的移動總距離和移動速度顯著增加,提示小鼠出現精神分裂癥陽性癥狀。同時,本研究還發現,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠在曠場中心區域滯留的時間顯著降低,這可能與小鼠的焦慮行為有關,與精神分裂癥陽性癥狀一致。臨床研究也發現,約65%精神分裂癥患者會出現焦慮狀行為[14]。為進一步驗證小鼠的焦慮行為,本研究采用高架十字迷宮評價小鼠的焦慮情況。結果顯示,前額皮層Nrg1基因敲低小鼠更加傾向于進入封閉臂,進入開放臂的時間百分比和次數百分比顯著低于正常對照組,表明Nrg1基因敲低會導致小鼠出現焦慮樣行為異常。以上結果表明,前額皮層Nrg1基因敲低會導致小鼠出現精神分裂癥樣的前脈沖抑制損傷、自發活動量增加和焦慮樣行為,與臨床上觀察到的精神分裂癥患者陽性癥狀一致。

為初步探究前額皮層Nrg1基因敲低誘導精神分裂癥陽性癥狀的分子機制,本研究檢測了抑制性神經元標志物VGAT和興奮性神經元標志物VGLUT1的表達水平。VGAT為γ-氨基丁酸轉運體,VGLUT1為谷氨酸轉運體,其發揮轉載神經遞質進入囊泡并釋放進入突觸間隙的作用,調節突觸間抑制性和興奮性神經遞質的平衡[15]。本研究結果顯示,前額皮層Nrg1基因敲低增加了前額皮層VGLUT1蛋白的表達水平,對VGAT蛋白表達沒有顯著影響,從而致前額皮層VGLUT1/VGAT比值升高,提示Nrg1基因敲低后突觸間興奮性神經遞質和抑制性神經遞質的轉運出現失衡,這可能是導致呈現精神分裂癥陽性癥狀的原因之一。多項研究采用質子磁共振光譜法發現,精神分裂癥患者中谷氨酸升高[16],結合本實驗結果中VGLUT1蛋白升高的現象,本研究后續可進一步探討谷氨酸代謝是否在Nrg1基因敲低導致的精神分裂癥樣行為異常中發揮作用。

本研究在成年C57BL/6小鼠模型中驗證了前額皮層Nrg1基因敲低誘發的精神分裂癥樣行為異常,避免了基因編輯動物維護成本高和周期長的缺陷,為后期快速構建精神分裂癥在體模型以及不同腦區精神分裂癥易感基因精準調控研究提供了新的方法學研究基礎。本實驗以成年小鼠為模型,與精神分裂癥神經發育假說的相關性還需加強,后期應進一步探究易感基因突變影響局部腦區神經發育異常的機制。

綜上所述,前額皮層Nrg1基因敲低可導致C57BL/6小鼠出現以前脈沖抑制損傷、自發活動量增加以及焦慮為特征的精神分裂癥樣行為改變,其分子機制可能與前額皮層γ-氨基丁酸和谷氨酸的轉運平衡失調有關。