基于轉錄組測序篩選高鹽培養下雙峰駝腎皮質細胞差異表達基因

陳麗慧 ， 薩日娜 , 寶 山 , 敖特根巴雅爾 ， 朝魯門格日樂 ，黃海峰 ， 孫 波 ， 額爾敦木圖 ， 楊 彬

(1.內蒙古農業大學獸醫學院 ， 內蒙古 呼和浩特 010018 ； 2.阿拉善盟動物衛生監督所 ， 內蒙古 巴彥浩特 750306 ；3.內蒙古自治區巴彥淖爾市農牧業科學研究所 ， 內蒙古 巴彥淖爾 015000 ； 4.鄂托克旗農牧局動物疫病預防控制中心 ，內蒙古 鄂爾多斯 016100 ； 5.阿拉善左旗農牧區生態管理綜合行政執法局 ， 內蒙古 巴彥浩特 750300；6.內蒙古阿拉善左旗巴潤別立鎮綜合保障和技術推廣中心 ， 內蒙古 巴彥浩特 750300)

雙峰駝長久以來一直生存在惡劣的干旱、缺水環境下，形成了獨特的抗逆性[1]。普通家畜長期飲用鹽堿水會直接導致其組織細胞滲透壓失調，引起機體代謝紊亂而無法正常生存，而雙峰駝長期飲用高濃度的鹽堿水，日常攝入的鹽量是其他家畜的6～8倍，卻能維持正常的生理機能[2]。這表明雙峰駝有著獨特的高鹽適應性，并具有強大的高鹽調節機制。已有研究表明，醛固酮可以通過調控腎小管上皮細胞對鈉的重吸收來調節細胞外液容量，從而維持血壓的平衡，并且腎皮質遠曲小管和集合管細胞中的上皮鈉離子通道(Epithelial sodium channels，ENaC)可以調控鈉離子的運轉以維持水鹽平衡[3]。本試驗以雙峰駝腎皮質細胞為研究對象，分別設立高滲組(Hyperosmotic stress，HS)和對照組(Control)，應用RNA-Seq轉錄組測序和分析技術，篩選出參與高鹽調控雙峰駝腎皮質細胞的差異表達基因。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 TRIzol試劑，購自美國Invitrogen 公司；NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit for Illumina?，購自杭州沃森生物技術有限公司；DMEM、膠原酶，均購自美國Gibco公司;胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，購自哈爾濱立峰生物工程有限公司；飽和NaCl溶液，購自北京酷來搏科技有限公司。滲透壓儀(Osmomat 030)，德國Gonotec公司產品；分光光度計(NanoDrop 2000)，美國Thermo Scientific公司產品；Agilent 2100 Bioanalyzer，美國Agilent公司產品；熒光定量PCR儀(ABI7900)，美國Applied Biosystems公司產品。

1.2 試驗動物及其樣本采集 將成年雄性阿拉善雙峰駝處死后迅速采集腎臟，切取腎臟皮質部分。用75%乙醇洗滌消毒后，保存于滅菌PBS中(內含1%青霉素-鏈霉素混合液)，供后續細胞培養試驗使用。

1.3 方法

1.3.1 雙峰駝腎皮質細胞的分離培養 采集好的雙峰駝腎皮質通過組織塊貼壁法培養腎皮質細胞。腎臟皮質碎片在0.1% I型膠原酶的消化下，培養溫度37 ℃，搖床轉速200 r/min，消化時間1 h。消化至組織成蓬松絮狀，離心后去掉消化液，加入含高糖DMEM、20% FBS、1%青霉素-鏈霉素混合液的細胞培養基，裝于細胞瓶中。細胞瓶置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.3.2 高滲處理腎皮質細胞 為了篩選出受高鹽調控的基因，試驗分為2個組，即高滲組和對照組,每組4個 樣本。利用滲透壓儀測量培養基滲透壓。高滲組：加入NaCl溶液配制滲透壓為600 mOmol/kg的高滲培養基，腎皮質細胞使用高滲培養基(DMEM，10% FBS，NaCl)培養48 h。對照組：經滲透壓儀測量培養基滲透壓為357 mOmol/kg，腎皮質細胞使用等滲普通培養基(DMEM，10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)培養48 h。

1.3.3 總RNA的抽提 使用TRIzol試劑抽提腎皮質細胞的總RNA，溶解于RNase-free水中。使用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA濃度和純度，Agilent 2100 Bioanalyzer 對RNA進行質量檢測，合格后用于后續測序。

1.3.4 RNA-Seq檢測數據的處理 對轉錄組測序原始數據進行過濾，獲得高質量的有效測序數據。并對測序深度進行校正，得到標準化(Normalization)數據。即通過統計學模型進行假設檢驗概率(Pvalue)的計算，并進行多重假設檢驗校正，得到經過校正的P值(AdjustPvalue，Padj)。采用差異表達倍數(Fold-change)法，對數據中基因的表達進行定量，即使用Subread軟件中的FeatureCounts工具，將原始數據轉換為FPKM數據，計算出基因的差異表達倍數。定義Padj<0.05且|log2(Fold-change)|>1的基因為差異表達基因(Differential expression gene，DEGs)。并對篩選出受高鹽調控明顯的DEGs進行基因本體論(Gene Ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析。

1.3.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測基因表達水平 為了驗證RNA-Seq結果數據的準確性，隨機抽取其中3個基因進行qRT-PCR。本試驗采用SYBR Green檢測法，以GAPDH為內參基因進行qRT-PCR。所用的引物序列見表1，qRT-PCR結果以Ct值的形式直觀展現，對各樣本的目的基因和內參基因分別進行擴增，每個反應重復3次。qRT-PCR的反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40個循環。PCR反應結果數據采用2-ΔΔCt法進行比較和分析，計算各個基因相對于GAPDH基因的表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物

2 結果

2.1 RNA-Seq測序數據分析 RNA-Seq檢測總共得到21 901條mRNA。根據篩選條件|log2(Fold-change)|>1且Padj<0.05,最終篩選出受高鹽調控顯著的DEGs共計4 854個，其中上調的基因有3 407個，下調的基因有1 447個。

2.2 qRT-PCR檢測RNA-Seq的準確性 為了驗證RNA-Seq的準確性，隨機選擇3個高滲處理后顯著差異的基因。對這些基因進行qRT-PCR檢測，分別測定其相對于內參基因GAPDH的表達水平。每個樣本設3個重復，qRT-PCR結果以2-ΔΔCt值的形式直觀展現。分別計算RNA-Seq測序中3個基因的log2(Fold-change)值，以此作為基因的相對表達水平。結果如圖1所示，測得3個基因在qRT-PCR中的相對表達水平與RNA-Seq的檢測結果總體表達趨勢一致，表明本次RNA-Seq測序結果是可靠的。

圖1 差異表達基因的qRT-PCR檢測

2.3 DEGs的GO注釋分析 對腎皮質細胞中受高鹽調控明顯的DEGs進行GO注釋分析，結果如圖2所示，這些基因主要在生物進程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)中發揮作用。

圖2 高滲處理下雙峰駝腎皮質細胞中DEGs的GO分類

在BP中，DEGs主要富集在兩方面：一方面富集在免疫相關的途徑：免疫系統的過程(Immune system process)、免疫反應(Immune response)、抗原處理和遞呈(Antigen processing and presentation)和免疫系統過程的調節(Regulation of immune system process)；另一方面富集在運輸相關的途徑：離子運輸(Ion transport)、跨膜運輸(Transmembrane transport)、鉀離子運輸(Potassium ion transport)和鈉離子運輸(Sodium ion transport)。除此之外，還富集在內生性刺激反應(Response to endogenous stimulus)、化學反應(Response to chemical)等。

在CC中，DEGs主要富集在胞外區(Extracellular region)、MHC蛋白復合物(MHC protein complex)、MHCⅡ類蛋白復合物(MHC class II protein complex)、質膜(Plasma membrane)、質膜部分(Plasma membrane part)、DNA包裝復合物(DNA packaging complex)、核小體(Nucleosome)、蛋白質DNA復合物(Protein-DNA complex)、細胞外圍(Cell periphery)和質膜蛋白復合物(Plasma membrane protein complex)。

在MF中，DEGs主要富集在兩方面：一方面是物質活動相關途徑：G蛋白偶聯受體活動(G-protein coupled receptor activity)、核酸結合轉錄因子活動(Nucleic acid binding transcription factor activity)、離子通道的活動(Ion channel activity)、通道活動(Channel activity)、被動跨膜轉運蛋白活動(Passive transmembrane transporter activity)、底物特異性通道活動(Substrate-specific channel activity)和蛋白質二聚活動(Protein dimerization activity)；另一方面是物質結合相關途徑：受體結合(Receptor binding)、轉錄因子活性，序列特異性DNA結合(Transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)和序列特異性DNA結合(Sequence-specific DNA binding)。

2.4 DEGs的KEGG富集分析 對DEGs進行KEGG富集分析，將Padj<0.05的生物途徑定義為DEGs顯著富集KEGG途徑。結果如表2所示，受到高鹽環境的影響，DEGs顯著富集在輔助因子和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、信號傳導(Signal transduction)、信號分子相互作用(Signaling molecules and interaction)、運輸和分解代謝(Transport and catabolism)和免疫系統(Immune system)等46條顯著KEGG途徑。DEGs中受高鹽調控顯著的信號通路有鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、JAK-STAT信號通路(JAK-STAT signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)和MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)，且有多個基因同時涉及多條途徑。例如：鳥苷酸交換因子 1(SOS1)基因同時參與JAK-STAT信號通路(JAK-STAT signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)和趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)等。

表2 差異表達基因顯著富集的KEGG途徑

2.4.1 新陳代謝 KEGG Pathway數據庫將生物代謝通路分為3個層次，新陳代謝(Metabolism)屬于一級代謝中的一種，其主要分為碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、能量代謝(Energy metabolism)和輔助因子和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)等12個二級代謝途徑。KEGG分析結果顯示，17個DEGs富集在輔助因子和維生素代謝中的視黃醇新陳代謝(Retinol metabolism)，主要有RDH12、DHRS9、RDH10、DHRS3、LRAT等基因參與代謝。

2.4.2 環境信息處理 環境信息處理(Environmental information processing)可分為膜轉運(Membrane transport)、信號轉導(Signal transduction)、信號分子及其相互作用(Signaling moleculesand interaction)共3個代謝通路。在腎皮質細胞中DEGs主要富集在信號轉導和信號分子及其相互作用。

續表2

在信號傳導途徑中，61個DEGs參與鈣信號通路(Calcium signaling pathway),如GNA15、PRKCB、NOS2、PDGFRB、AVPR1A等基因。48個DEGs參與JAK-STAT信號通路(JAK-STAT signaling pathway),如CNTF、PIK3R3、OSMR、IL7、SOS1等基因。84個DEGs參與PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)，如SGK1、PIK3R3、IL2RG、TLR4、SOS1等基因。71個DEGs參與MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)，如HSPA1L、RAC2、DUSP6、TGFB2、IL1B等基因。

在信號分子及其相互作用途徑中，CNTF、IL1RN、CCR1、IL2RG、CRLF2等100個DEGs涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)；C3、C5AR1、ADORA1、CYSLTR2、TRPV1等107個DEGs涉及神經活性配體受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)；LOC105064248、SELPLG、ICAM3、ITGB7、CD28等42個DEGs涉及細胞黏附分子(Cell adhesion molecules)；COL2A1、COL6A1、ITGB3、TNXB、ITGB7等27個DEGs涉及ECM受體相互作用(ECM-receptor interaction)。

2.4.3 細胞過程 細胞進程分為運輸和分解代謝(Transport and catabolism)、細胞生長與死亡(Cell growth and death)、細胞活性(Cell motility)等5個二級代謝途徑。根據KEGG分析結果顯示，在腎皮質細胞中共有50個DEGs富集在運輸和分解代謝中的吞噬體(Phagosome)，主要有MSR1、ITGB2、CTSS、ATP6V0D2、TLR4等基因參與吞噬體的途徑。

2.4.4 有機體系統 有機體系統(Organismal systems)主要包括免疫系統(Immune system)、循環系統(Circulatory system)、消化系統(Digestive system)、神經系統(Nervous system)和感覺系統(Sensory system)等9個系統。根據KEGG分析結果顯示，在腎皮質細胞中共有306個DEGs涉及免疫系統；主要有CD14、CSF1R、IL1A、IL7、EPO等50個基因參與造血細胞譜系(Hematopoietic cell lineage)；IL2RG、DLL1、IFNGR1、FOS、JAK3等35個基因參與Th1和Th2細胞分化(Th1 and Th2 cell differentiation)；C3、C5AR1、MASP2、MBL2、KLKB1等30個基因參與補體和凝血級聯(Complement and coagulation cascades)；TYROBP、FCER1G、ITGB2、PIK3R3、SOS1等33個基因參與自然殺傷細胞介導的細胞毒性(Natural killer cell mediated cytotoxicity)；LOC105064248、CD86、ITGB7、IL5、TNFRSF13C等20個基因參與腸道免疫網絡的IgA生產(Intestinal immune network for IgA production)；PRKCB、TIAM1、SOS1、CCR4、GRK4等48個基因參與趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)；CD74、HSPA1L、CTSS、HSPA2、CD4等22個基因參與抗原處理和遞呈(Antigen processing and presentation)；FCER1G、FERMT3、PIK3R3、BTK、ITGB3等37個基因參與血小板激活(Platelet activation)；IL2RG、IRF4、IFNGR1、FOS、MAPK11等31個基因參與Th17細胞分化(Th17 cell differentiation)。

38個DEGs涉及循環系統中的血管平滑肌收縮(Vascular smooth muscle contraction)，分別有NPPC、PRKCBPLCB2、GNA11、ADM、AVPR1A等基因。

51個DEGs涉及消化系統；主要有SLC38A2、KCNK5、ATP1B2、COL2A1、SLC1A5等29個基因參與蛋白質消化吸收(Protein digestion and absorption)；PRKCB、ATP1B2、PLCB2、KCNJ15、KCNJ1等22個基因參與胃酸分泌(Gastric acid secretion)。

33個DEGs涉及神經系統中的含血清素的神經突觸(Serotonergic synapse)，主要有PRKCB、NRAS、PLCB2、ALOX5、SLC18A2等基因參與。

39個DEGs涉及感覺系統中的破骨細胞分化(Osteoclast differentiation)，主要有TREM2、TYROBP、SPI1、PIK3R3、IL1B等基因。

2.5 篩選參與高鹽代謝的重要基因 本試驗對高滲組和對照組的KEGG差異途徑的對比結果顯示，篩選出了多個參與高鹽調控的重要基因(表3)。提示這些基因的表達可能與雙峰駝腎皮質細胞耐受高鹽的機制有關。

表3 參與雙峰駝腎皮質細胞高鹽調控的重要基因

3 討論

高鹽環境是影響動物生長發育的逆境之一。長期采食高鹽食物，將導致血液中鈉離子滯留，保水能力提升，造成高血壓等疾病[4]。然而雙峰駝長期攝入高鹽堿食物不會出現高血壓等病癥，說明為了適應高鹽環境，雙峰駝在進化過程中形成了特殊的高鹽代謝機制。鹽分調節是細胞基礎生理活動之一。目前腎皮質細胞在高鹽環境下的適應和保護機制仍然有很多未知的地方。

GO富集分析顯示，高鹽誘導下DEGs主要在免疫途徑、離子運輸途徑、質膜部分、物質活動途徑和物質結合途徑顯著富集。其中在BP中，DEGs重點富集在免疫相關的途徑：免疫系統過程、免疫反應等。研究表明，鈉離子在組織中積聚會引起炎癥[5]。參與炎癥反應的免疫細胞可以對高血壓進行調控。高鹽造成的滲透壓升高，會促進巨噬細胞、T淋巴細胞等免疫細胞的活性并滲入腎臟，進而影響高血壓的發生[6]。可以推測免疫途徑在調控高鹽誘導的高血壓中發揮重要的作用。DEGs還顯著富集在離子運輸相關的途徑：鉀離子運輸、鈉離子傳輸等。這些離子的運轉在滲透調控中發揮重要作用。鈉、鉀離子是水鹽代謝的重要組成成分，細胞外液鈉離子的濃度是決定細胞外液滲透壓的主要因素。可以推測雙峰駝通過細胞內離子的運輸來調節高鹽對機體的影響，確保細胞的滲透壓能夠維持在正常的生理水平。

在CC方面，DEGs重點富集在胞外區、細胞外圍等；還富集在各種蛋白復合物的合成途徑：MHC蛋白復合物、MHCⅡ類蛋白復合物和DNA包裝復合物等；富集在質膜相關途徑：質膜、質膜部分、質膜蛋白復合物等。說明高鹽主要作用于質膜部分和各種大分子復合物的合成。

在MF中，高鹽下的DEGs主要富集在物質活動相關的途徑：G蛋白偶聯受體活動、核酸結合轉錄因子活動、離子通道的活動等；還富集在物質結合相關的途徑：受體結合、序列特異性DNA結合等。這些途徑的富集，表明高鹽的攝入會導致各種蛋白質的合成和跨膜相關活動的發生。推測高鹽可以通過調控各種大分子活動，響應高鹽誘導對腎皮質細胞的影響。

KEGG富集分析表明，雙峰駝腎皮質細胞在高鹽誘導下，DEGs主要富集在輔助因子和維生素代謝、信號轉導、信號分子相互作用、運輸和分解代謝、免疫系統等途徑。本試驗結果表明，參與調控代謝的信號傳導通路可能幫助雙峰駝在高鹽環境的脅迫下產生一系列的適應和保護機制。一些重要的基因參與信號通路的調控：AVPR1A、SOS1、TGFB1參與鈣離子信號通路、JAK-STAT信號通路和MAPK 信號通路。

AVPR1A基因在鈣離子信號通路上調表達。AVPR1A是精氨酸加壓素(AVP)的受體。AVP已知在高滲刺激下水平會不斷升高，持續升高的AVP可以刺激腎小管細胞增殖[7]，還可以刺激腎皮質集合管進行尿濃度的調節，并且AVP可以依賴水通道蛋白2 (AQP2)介導加壓素調節的水分重吸收[8]。因此可以推測AVPR1A基因可能參與AVP介導的腎皮質腎小管上皮細胞在高鹽刺激下的增殖，還可能參與腎皮質集合管的水分重吸收。

JAK-STAT信號通路在細胞因子介導的免疫調節中發揮重要的作用，并參與細胞的增殖、分化、凋亡[9]。有研究表明，SOS1和SOS2基因可以對外周T細胞的信號傳導和功能產生作用[10]。而且SOS2在腎臟的發育過程中發揮重要作用，敲除SOS2基因會造成腎小管形態發生改變[11]。可以推測SOS家族基因可能調控腎臟的發育，對高鹽環境下皮質腎小管的形態的維持發揮作用，還可以推測SOS1在JAK-STAT信號通路的上調，能夠促進免疫細胞的產生來調節高鹽誘導的免疫反應。

TGFB1基因參與 MAPK信號通路。TGFB1是TGFBs轉化生長因子家族成員之一。TGFB1已知可通過Smad4依賴途徑降低腎皮質集合管細胞上皮鈉通道(ENaC)功能[12]。并且TGFB1基因可以阻斷醛固酮對ENaC活性和鈉轉運的刺激作用，還可以降低ENaC的表達和鈉泵功能[13]。在本試驗的高鹽誘導下，TGFB1基因在MARK信號通路中顯著下調，推測其促進了ENaC的活性并激活了腎皮質集合管細胞上的鈉運轉。

Toll樣受體(TLR)是存在于細胞表面的跨膜蛋白,對機體免疫具有重要意義。最近的研究證明，TLR在腎臟疾病的發生機制中發揮著重要作用[14]。其中，Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)在運輸和分解代謝中的吞噬體途徑發揮作用。激活TLR2和TLR4可以導致腎小管上皮細胞中促炎細胞因子(TNF、IL-6、IL-1α)的合成與分泌增多[15]。TLR4在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的腎小管上皮細胞中參與高血壓腎損害的微炎癥反應[16]。推測在高鹽調控下，雙峰駝腎皮質細胞TLR2、TLR4基因表達的下調可能通過減少高鹽對腎細胞的炎癥反應的發生，從而發揮高鹽耐受的作用。

綜上所述,本試驗利用轉錄組測序分析,針對雙峰駝腎皮質細胞進行研究,旨在從基因層面了解雙峰駝適應高鹽環境的根本原因,從而篩選出參與高鹽調控一系列候選基因。這些在富集途徑中高表達的基因，是雙峰駝適應高鹽環境的基礎，豐富了我們對雙峰駝鹽分調節分子機制的認知，為解釋雙峰駝在極端環境下獨特的生理特性提供了重要參考，也為未來高血壓的防治提供了新思路。